这9种功能的保健食品可以正常注册备案申报啦！

时间： 2022-02-28 作者：来源：

导读： 2018年7月，国家卫生健康委员会发布了《关于宣布失效第三批委文件的决定》，宣布《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）废止。《规范》是保健食

2018年7月，国家卫生健康委员会发布了《关于宣布失效第三批委文件的决定》，宣布《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）废止。《规范》是保健食品研发、检测、注册申报的重要文件之一，内容包括27项保健食品功能学评价程序与检验方法规范、18项保健食品毒理学评价程序与检验方法规范和27项保健食品功效成分及卫生指标检验规范等。此举使我国的保健食品新产品备案注册工作在此后的两年内基本处于停滞状态。

2020年10月16日，国家市场监督管理总局同时发布了《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则(2020年版）》、《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版）》、《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则（2020年版）》三个文件，这些文件的发布，客观上部分结束了保健食品备案注册申报检验长时间无法可依的局面，让苦苦等待的申请企业看到了曙光。

《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则(2020年版）》依据食品安全国家标准GB 15193系列标准制定。适用于保健食品及其原料的安全性毒理学的检验与评价。受试物为保健食品或保健食品原料。规定保健食品应提供包装完整的定型产品。毒理学试验所用样品批号应与功能学试验所用样品批号一致，并且为卫生学试验所用三批样品之一（益生菌、奶制品等产品保质期短于整个试验周期的产品除外）。根据技术审评意见要求补做试验的，若原批号样品已过保质期，可使用新批号的样品开展试验，但应提供新批号样品按产品技术要求检验的全项目检验报告。

同时，还提出了保健食品安全性的重新评价的规定，指出安全性评价的依据不仅仅是安全性毒理学试验的结果，而且与当时的科学水平、技术条件以及社会经济、文化因素有关。因此，随着时间的推移，社会经济的发展、科学技术的进步，当对原料或产品的安全性研究有新的科学认识时，应结合产品上市后人群食用过程中发现的安全问题以及管理机构采取的与安全有关的管理措施，对产品的安全性进行重新评价。

《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版）》规定了保健食品原料用细菌、丝状真菌（子实体除外）和酵母的安全性评价中的致病性（毒力）检验与评价程序和方法。适用于保健食品原料用菌种（包括保健食品配方用及原料生产用菌种）的致病性检验与评价。本指导原则不适用于基因改造微生物菌种和在我国无使用习惯的菌种致病性检验与评价。

《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则（2020年版）》规定了保健食品及其原料、辅料理化及卫生指标检验与评价的基本要求、功效成分/标志性成分检验方法、溶剂残留和违禁成分的测定要求。本指导原则适用于保健食品的注册和备案检验。《原则》对保健食品理化及卫生指标检验与评价提出了基本要求，并推荐了22种保健食品功效成分的检测方法。要求保健食品中原料和辅料应符合保健食品原辅料质量要求的有关规定，有适用的国家相关标准、地方标准、行业标准等的，其质量应符合相关规定。

结合以上三个《指导原则》的发布实施，根据2012年国家食品药品监督管理局印发的抗氧化功能评价方法等9个保健功能评价方法，目前此9种功能的保健食品可以开展正常注册申请，这9种功能是：抗氧化功能、对胃粘膜损伤有辅助保护功能、辅助降血糖功能、缓解视疲劳功能、改善缺铁性贫血功能、辅助降血脂功能、促进排铅功能、减肥功能和清咽功能。

（信息提供：北京天健华成国际投资顾问有限公司保健食品注册部www.zhuceabc.cn；咨询微信：1801335159）

国家食品药品监督管理局要求进一步加强保健食品注册管理工作

为深入贯彻落实《食品安全法》及其实施条例，进一步加强保健食品监管和规范注册各环节工作，严把保健食品准入关，日前，国家食品药品监督管理局就有关事项再次发出通知。

　　通知强调，各省（区、市）食品药品监管部门要进一步加大对保健食品注册申报资料规范性、完整性的审查力度，要进一步加强保健食品样品试制和试验现场核查工作，严格按照现场核查规定的要求，真实、准确、规范地填写核查意见和核查结论。注册检验机构应当严格按照规定开展保健食品注册检验复核检验工作，严格执行各项程序要求，加强注册检验复核检验管理，确保检验报告各项数据科学、真实、准确。保健食品审评专家和审评专家委员会应当严格按照国家有关法律法规、标准规范对申报资料进行技术审评，科学、公正、独立、客观地提出审评意见。技术审评部门要进一步加强技术审评工作的组织和管理，严格按照规定开展技术审评意见的审核并提出审核结论。行政审批部门要进一步完善审评审批程序，建立健全监督制约机制，严格依法规按程序开展行政审批。

通知要求，各有关部门、单位和人员要严格遵守工作纪律，不得借产品注册之机谋取私利，要严格执行保密规定，不得违反规定对外透露任何可能影响产品注册公正性的信息。对任何违法违规行为，一经查实，国家食品药品监督管理局将坚决依法严肃处理。

国家食品药品监督管理局印发抗氧化功能评价方法等9个保健功能评价方法

为贯彻落实《食品安全法》及其实施条例对保健食品实行严格监管的要求，加强保健食品准入管理，切实提高准入门槛，国家食品药品监督管理局组织修订了抗氧化等9个功能的评价方法，已经保健食品安全专家委员会审议通过，并于日前印发。自2012年5月1日起，对受理的申报注册保健食品的相关产品检验申请，保健食品注册检验机构应当按照新发布的9个功能评价方法开展产品功能评价试验等各项工作。

　　9个功能评价方法包括：抗氧化功能评价方法、对胃粘膜损伤有辅助保护功能评价方法、辅助降血糖功能评价方法、缓解视疲劳功能评价方法、改善缺铁性贫血功能评价方法、辅助降血脂功能评价方法、促进排铅功能评价方法、减肥功能评价方法和.清咽功能评价方法。

附件： 1．抗氧化功能评价方法
　　　　　2．对胃粘膜损伤有辅助保护功能评价方法
　　　　　3．辅助降血糖功能评价方法
　　　　　4．缓解视疲劳功能评价方法
　　　　　5．改善缺铁性贫血功能评价方法
　　　　　6．辅助降血脂功能评价方法
　　　　　7．促进排铅功能评价方法
　　　　　8．减肥功能评价方法
　　　　　9．清咽功能评价方法

促进排铅功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目

1.1 动物实验

1.1.1体重

1.1.2血铅

1.1.3骨铅

1.1.4肝组织铅

1.2 人体试食试验

1.2.1血铅

1.2.2尿铅

1.2.3尿钙

1.2.4尿锌

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

2.2 应对临床症状、体征进行观察。

2.3 应对尿铅进行多次测定，以了解体内铅的排出情况。

2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验：实验组与模型对照组比较，骨铅含量显著降低，同时血铅或肝铅显著降低，可判定该受试样品动物实验结果为阳性。

3.2 人体试食试验：试食组与对照组组间比较，至少两个观察时点尿铅排出量增加且显著高于试验前，或总尿铅排出量明显增加。同时，对总尿钙、总尿锌的排出无明显影响，或总尿钙、总尿锌排出增加的幅度小于总尿铅排出增加的幅度，可判定该受试样品具有促进排铅功能。
促进排铅功能检验方法 Method for the Assessment of Alleviating Lead Excretion Function

1 动物实验

1.1 实验原理

实验动物经口给予含铅化合物（推荐使用醋酸铅），可造成组织中铅含量增高。造模早期以肝、肾等组织中增高明显，之后骨组织中铅含量逐渐增高。比较给予实验动物受试样品后，模型动物组织中铅含量的变化情况，以确定此受试样品是否具有促进机体排铅的作用。

1.2 实验动物

推荐使用成年大鼠，单一性别，体重150－200克，每组8－12只。小鼠则应使用近交系动物，单一性别，体重18－22克，每组10－15只。

1.3剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组、一个空白对照组和一个模型对照组，三个剂量组中应包括一个人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）剂量组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.4 实验设计

本实验使用预防性高铅动物模型。

实验期间，在模型对照组、受试样品各剂量组饮用醋酸铅水溶液（推荐浓度为0.1%－0.2%）或喂饲含铅饲料造模的同时，各剂量组灌胃给予受试样品或喂饲含不同剂量受试样品的饲料。空白对照组给予去离子水或基础饲料。

1.5 观察指标

于末次给予动物受试样品24小时后，称量动物体重。取血并处死动物，取适量血、肝、股骨样品进行湿式消化，使用石墨炉原子吸收分光光度计（或ICP-MS等方法）测定铅含量。

1.6 数据处理和结果判定

一般采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，则计算F值。若F值< F_0.05，结论为各组均数间差异无显著性；若F值≥F_0.05（即P≤0.05），结论为各组均数间差异有显著性，需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换后的数据进行统计分析；若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的，则改用秩和检验进行统计分析。

结果判定：在动物模型成立的前提下，实验组与模型对照组比较，骨铅含量显著降低，同时血铅或肝铅显著降低，可判定该受试样品动物实验结果为阳性。

2 人体试食试验

2.1 受试者纳入标准

有密切铅接触史，血铅含量较高的自愿受试者。推荐选择属于血铅负荷偏高的人群，即血铅在200mg/L－400mg/L（1mmol/L－2mmol/L）范围内，或尿铅在70mg/L－120mg/L（0.34mmol/L －0.58mmol/L）范围内者。

2.2 受试者排除标准

2.2.1血铅或尿铅过高，有明显铅中毒症状者。

2.2.2患有心血管、肝、肾和造血系统等全身性疾病者。

2.2.3妊娠和哺乳期妇女。

2.2.4试验期间服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。

2.2.5停服受试样品或中途加服其它药物，无法判断功效或资料不全者。

2.3. 试验设计及分组要求

采用自身和组间两种对照设计。按血铅或尿铅水平对受试者进行随机分组，在分组时尽可能考虑影响结果的主要因素如铅接触史、年龄、性别等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者有效例数不少于50例。

2.4.受试样品的剂量和使用方法

试食组按推荐服用方法和服用量每日服用受试样品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。试验期间受试者不改变生活、工作环境，不改变原来生活、饮食习惯。

2.5.观察指标

2.5.1安全性指标

2.5.1.1 一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）。

2.5.1.2 血、尿、便常规检查。

2.5.1.3 肝、肾功能检查。

2.5.1.4 胸透、心电图、腹部B超检查（各项指标于试验前检查一次）。

2.5.1.5 尿钙、尿锌的测定：测定时间、次数和方法同尿铅。总尿钙、总尿锌为试验开始后3次尿钙或尿锌测定值之和。

2.5.2功效性指标：

2.5.2.1 临床症状观察：准确记录受试者试食前后的主观症状，主要观察头晕、失眠、四肢无力等症状。

2.5.2.2 血铅、尿铅含量测定：采集试食试验前、试验后血液，以及试食前及试食第10天（如进行45天试验则为第15天）、20天（如进行45天试验则为第30天）和结束时的24小时尿液样本（亦可以晨尿代替24小时尿，但需用尿肌酐进行校正），测定血铅、尿铅含量。总尿铅为试验开始后三次尿铅测定值之和。

2.6 数据处理和结果判定

血铅、尿铅、尿钙、尿锌等试验数据为计量资料，可用t检验进行分析。自身对照资料可采用配对t检验；试食后不同观察时点两组血铅、尿铅的测定值均数比较以及试食后两组总尿铅、总尿钙、总尿锌排出量比较采用两样本均数t检验。后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换的数据进行t检验；若经数据转换仍不能满足正态分布或方差齐要求，则改用t’检验或秩和检验。对于变异系数太大（如CV>50％）的资料，应使用秩和检验。

结果判定：试食后，试食组与对照组组间比较，至少两个观察时点尿铅排出量增加且显著高于试验前，或总尿铅排出量明显增加。同时，对总尿钙、总尿锌的排出无明显影响，或总尿钙、总尿锌排出增加的幅度小于总尿铅排出增加的幅度，可判定该受试样品具有促进排铅功能。

辅助降血糖功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目

1.1 动物实验

分为方案一（胰岛损伤高血糖模型）和方案二（胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型）两种

1.1.1方案一（胰岛损伤高血糖模型）

1.1.1.1 体重

1.1.1.2 空腹血糖

1.1.1.3 糖耐量

1.1.2方案二（胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型）

1.1.2.1 体重

1.1.2.2 空腹血糖

1.1.2.3 糖耐量

1.1.2.4 胰岛素

1.1.2.5 总胆固醇

1.1.2.6 甘油三酯

1.2 人体试食试验

1.2.1空腹血糖

1.2.2餐后2小时血糖

1.2.3糖化血红蛋白（HbA1c）或糖化血清蛋白

1.2.4总胆固醇

1.2.5甘油三酯

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

2.2 根据受试样品作用原理不同，方案一和方案二动物模型任选其一进行动物实验。

2.3 除对高血糖模型动物进行所列指标的检测外，应进行受试样品对正常动物空腹血糖影响的观察。

2.4 人体试食试验应在临床治疗的基础上进行。

2.5 应对临床症状和体征进行观察。

2.6 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验：

方案一：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。

方案二：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，血脂（总胆固醇、甘油三酯）无明显升高，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。

3.2 人体试食试验：空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白）、血脂四项指标均无明显升高，且空腹血糖、餐后2小时血糖两项指标中一项指标阳性，对机体健康无影响，可判定该受试样品具有辅助降血糖功能的作用。

清咽功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目

1.1 动物实验

1.1.1体重

1.1.2大鼠棉球植入实验

1.1.3大鼠足趾肿胀实验

1.1.4小鼠耳肿胀实验

1.2 人体试食试验：咽部症状、体征

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

2.2 应对临床症状、体征进行观察。

2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验：大鼠棉球植入实验结果阳性，同时大鼠足趾肿胀实验或小鼠耳肿胀实验结果任意一项阳性，可判定该受试样品清咽功能动物实验结果为阳性。

3.2 人体试食试验：试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，咽部症状及体征有明显改善，症状及体征的改善率明显增加，可判定该受试样品具有清咽功能。
清咽功能检验方法 Method for the Assessment of Clear the Throat Function

1 动物实验

1.1 大鼠棉球植入实验

1.1.1实验原理

采用棉球作为异物植入动物局部皮下，可引起与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽组织增生。比较给予受试样品后，实验组动物与对照组动物肉芽肿重量的差异，以确定受试样品是否具有干预慢性炎症（肉芽肿形成）的作用。

1.1.2实验动物

推荐使用成年雄性大鼠，体重150－220克。每组8－12只。

1.1.3剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个空白对照组，三个剂量组中应包括一个人体推荐量5倍的剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.1.4仪器和材料

手术器械、恒温干燥箱、分析天平、注射器、乙醚、碘伏、脱脂棉、脱毛器

1.1.5实验步骤

1.1.5.1 棉球的处理将脱脂棉制成约20~25mg紧致的小棉球，经高压灭菌后，置恒温干燥箱60°C干燥3h，取出无菌条件下称重，干燥保存，备用。

1.1.5.2 肉芽肿的形成和测定

实验结束前8天，用脱毛器脱去大鼠两侧腹股沟处的毛，乙醚浅麻醉大鼠，碘伏消毒，在无菌条件下切开大鼠两侧腹股沟皮肤，植入备用的棉球，缝合切口，继续给予受试物。实验结束当天，给受试物1小时后，断颈处死大鼠，在原缝合处剪开皮肤，剥离并取出棉球肉芽组织，置于已称重洁净平皿中，恒温干燥箱60°C开盖干燥1小时后称重，计算肉芽肿净量。
肉芽肿净量（mg）＝干燥后棉球肉芽肿重量－原棉球重量

1.1.6数据处理和结果判定

一般采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，则计算F值。若F值< F0.05，结论为各组均数间差异无显著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05），结论为各组均数间差异有显著性，需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换后的数据进行统计分析；若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的，则改用秩和检验进行统计分析。

结果判定：实验组与空白对照组比较，肉芽肿净量明显下降，经统计处理差异有显著性，可判定该受试样品大鼠棉球植入实验结果阳性。

1.1.7注意事项

1.1.7.1 所用棉球重量及表面积对实验结果影响较大，故在实验中，应尽可能保证所用棉球重量和表面积近似。

1.1.7.2 尽量使手术切口的大小一致，以减少差异。

1.1.7.3 植入棉球后，将切口缝合牢固，以免在实验过程中棉球脱落，影响实验结果。

1.2 大鼠足趾肿胀实验

1.2.1实验原理

一定量致炎剂注入大鼠后肢足趾皮下，可造成足趾肿胀。测定足趾容积，比较致炎剂作用前后实验组和对照组足趾容积的变化，以确定受试样品是否具有干预急性炎症（足趾肿胀）的作用。

1.2.2实验动物

同1.1.2。

1.2.3剂量分组及受试样品给予时间

同1.1.3

1.2.4仪器和材料：

致炎剂（推荐使用葡聚糖4万）、足趾容积测量仪、无菌蒸馏水、0.25ml注射器。

1.2.5实验步骤

1.2.5.1致炎剂的配制用无菌蒸馏水配制浓度为1%的葡聚糖4万，备用。

1.2.5.2 足趾肿胀及测定实验结束当天再给受试样品一次，1小时后，用足趾容积测量仪测量各组大鼠右后足趾的容积，作为0小时足趾容积。然后在大鼠右后足趾皮下注入1％葡聚糖4万0.1mL/只，分别于1、2、4、6小时测量大鼠足趾的容积，同一部位测量3次，取平均值。以不同时间所测足趾容积与致炎剂作用前的足趾容积之差为肿胀值，计算各个时间段的足趾肿胀率。
肿胀率（%）=肿胀值／致炎前足趾容积×100％

1.2.6数据处理和结果判定

一般采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，则计算F值。若F值< F0.05，结论为各组均数间差异无显著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05），结论为各组均数间差异有显著性，需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换后的数据进行统计分析；若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的，则改用秩和检验进行统计分析。

结果判定：实验组与空白对照组比较，任一时间点刺激前后足趾容积肿胀率明显减少，差异有显著性，可判定该受试样品大鼠足趾肿胀实验结果阳性。

1.2.7注意事项

1.2.7.1 致炎剂注入的质量对实验结果影响很大，注入致炎剂时，应将动物后肢拉直，从右后足掌心向踝关节方向皮下注射致炎剂，并应尽可能使动物不动。建议由专人负责致炎剂的注射，以保证实验结果的一致性。

1.2.7.2 测量足趾容积时，严格按仪器说明操作。注意应在鼠足某处用记号笔画线作为测量标线，将鼠足缓缓放入测量筒内，当水平面与鼠足上的测量标线重叠时，踏动脚踏开关，记录足趾容积，用吸水纸擦干鼠足上的水后，分别再进行第2次和第3次测定。为避免测量误差，测定人员应事先进行训练，掌握将鼠足放入测量筒内的最佳方式，每个样品的测量最好由专人进行。

1.2.7.3 每次测定的部位要固定。

1.3 小鼠耳肿胀实验

1.3.1实验原理

二甲苯为无色澄清液体，涂抹于小鼠耳廓后，由于其刺激作用，可引起鼠耳局部毛细血管充血，通透性增加，导致急性炎症。比较实验组和对照组二甲苯作用后耳肿胀率的差异，以确定受试样品是否具有干预急性炎症（小鼠耳肿胀）的作用。

1.3.2仪器和材料

直径9mm打孔器、致炎剂（二甲苯）、微量加样器、分析天平

1.3.3实验动物

推荐使用近交系雄性小鼠，体重18－22克，每组10－15只。

1.3.4剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个空白对照组，三个剂量组中应包括一个人体推荐量10倍的剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.3.5实验步骤

汲取二甲苯20μl，滴加在小鼠右耳外侧面耳廓的中央，让其自由扩散，30分钟后，将小鼠脱颈椎处死，剪下双耳，用9mm直径打孔器在两耳相同部位打下耳片并称重，以两耳重量之差为耳廓肿胀值，计算耳廓肿胀率。
耳廓肿胀率（%）=耳廓肿胀值／对照耳片重量×100％

1.3.6数据处理和结果判定

一般采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，则计算F值。若F值< F0.05，结论为各组均数间差异无显著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05），结论为各组均数间差异有显著性，需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换后的数据进行统计分析；若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的，则改用秩和检验进行统计分析。

结果判定：实验组与空白对照组比较，耳廓肿胀率明显减少，差异有显著性，可判定该受试样品小鼠耳肿胀实验结果阳性。

1.3.7注意事项

1.3.7.1 二甲苯具有对眼及上呼吸道有刺激作用，操作时，操作者应注意自身的防护。

1.3.7.2 打下的耳片应及时称重，以避免水分失去而影响实验结果的准确性。

2 人体试食试验

2.1 受试者纳入标准

2.1.1体征：慢性咽炎人群，主观症状有咽痛、咽痒、咽干、干咳、异物感、多言加重等。

2.1.2咽部症状：咽部粘膜水肿、粘膜充血、咽后壁淋巴滤泡增生、分泌物附着。

具有2.1.1及2.1.2中至少一项检查所见的自愿受试者，即可纳入观察。

2.2受试者排除标准

2.2.1慢性咽炎急性发作期或急性咽炎、声带结节、感冒或吸烟因素所致者。

2.2.2鼻咽、咽、喉、鼻、喉、食管、颈部及结核、转移性肺癌病变所致者。

2.2.3年龄在18岁以下或65岁以上者，妊娠和哺乳期妇女及对受试产品过敏者。

2.2.4合并有心、脑血管、肝、肾、造血系统、支气管和肺等严重疾病及精神病患者和有睡眠疾病的患者。

2.2.5短期内已服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。

2.2.6未按规定服用受试样品或中途加服其它药物，无法判断功效或资料不全者。

2.3 试验设计及分组要求

采用自身和组间两种对照设计。按受试者的咽部症状、体征随机分为试食组和对照组，分组时尽可能考虑影响结果的主要因素如病程、年龄、性别等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。

2.4 受试样品的剂量和使用方法

试食组按推荐服用方法和服用量每日服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照，也可使用具有清咽功能的保健食品作为对照。受试样品给予时间15天~30天。试验期间受试者不改变生活、工作环境，不改变原来生活、饮食习惯。

2.5 观察指标

2.5.1安全性指标

2.5.1.1 一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）

2.5.1.2 血、尿、便常规检查

2.5.1.3 肝、肾功能检查

2.5.1.4 胸透、心电图、腹部B超检查（试验前检查一次）

2.5.2功效性指标

2.5.2.1 症状观察

准确记录受试者试食前后的咽部主观症状，主要咽部症状包括：咽痛、咽痒、咽干、干咳、异物感多言加重等，按症状轻重计算积分（1度—1分，2度—2分，3度—3分），统计积分变化和症状改善率。

2.5.2.2 体征观察

咽部检查：咽部粘膜充血、粘膜水肿、咽后壁淋巴滤泡增生、分泌物等体征。

按检查结果的轻、中、重分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，分别记录试食前后体征变化，计算体征积分和改善率。

观察指标功效判定：

有效：症状减轻1度，咽部体征检查结果减轻I级

无效：症状、体征均无明显改变

2.6 数据处理和结果判定：

积分变化可用t检验进行分析。凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验；但变异系数太大（如CV>50％）的资料应用秩和检验。

改善率为计数资料，可用X²检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。

结果判定：试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，咽部临床症状、体征积分明显降低，且症状、体征改善率较对照组有明显增加，差异有显著性，可判定该受试样品具有清咽功能。

2.7 注意事项

因咽部症状检查带有较大的主观性，建议由专人负责所有受试者试食前后的检查，尽可能保证判断标准的一致性。

减肥功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目

1.1 动物实验

1.1.1体重、体重增重

1.1.2摄食量、摄入总热量

1.1.3体内脂肪重量（睾丸周围脂肪垫、肾周围脂肪垫）

1.1.4脂/体比

1.2 人体试食试验

1.2.1体重

1.2.2腰围、臀围

1.2.3体内脂肪含量

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

2.2 动物实验中大鼠肥胖模型法和预防大鼠肥胖模型法任选其一。

2.3 减少体内多余脂肪，不单纯以减轻体重为目标。

2.4 引起腹泻或抑制食欲的受试样品不能作为减肥功能食品。

2.5 每日营养素摄入量应基本保证机体正常生命活动的需要。

2.6 对机体健康无明显损害。

2.7 实验前应对同批受试样品进行违禁药物的检测。

2.8 以各种营养素为主要成分替代主食的减肥功能受试样品可以不进行动物实验，仅进行人体试食试验。

2.9 不替代主食的减肥功能试验，应对试食前后的受试者膳食和运动状况进行观察。

2.10 替代主食的减肥功能试验，除开展不替代主食的设计指标外，还应设立身体活动、情绪、工作能力等测量表格，排除服用受试样品后无相应的负面影响产生。结合替代主食的受试样品配方，对每日膳食进行营养学评估。

2.11 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验：

实验组的体重或体重增重低于模型对照组，体内脂肪重量或脂/体比低于模型对照组，差异有显著性，摄食量不显著低于模型对照组，可判定该受试样品动物减肥功能实验结果阳性。

3.2 人体试食试验：

不替代主食的减肥功能受试样品：试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，体内脂肪重量减少，皮下脂肪四个点中任两个点减少，腰围与臀围之一减少，且差异有显著性，运动耐力不下降，对机体健康无明显损害，并排除膳食及运动对减肥功能作用的影响，可判定该受试样品具有减肥功能的作用。

替代主食的减肥功能受试样品：试食组试验前后自身比较，其体内脂肪重量减少，皮下脂肪四个点中至少有两个点减少，腰围与臀围之一减少，且差异有显著性（P<0.05），微量元素、维生素营养学评价无异常，运动耐力不下降，情绪、工作能力不受影响，并排除运动对减肥功能作用的影响，可判定该受试样品具有减肥功能作用。

辅助降血脂功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

根据血脂异常的类型，辅助降血脂功能按照不同的血脂类型设立分类的动物试验和人体试食实验。

1 试验项目

1.1 根据受试样品的作用机制，分成三种情况

1.1.1辅助降低血脂功能：降低血清总胆固醇和血清甘油三酯

1.1.2辅助降低血清胆固醇功能：单纯降低血清胆固醇

1.1.3辅助降低血清甘油三酯功能：单纯降低血清甘油三酯

1.2 观察指标

1.2.1体重

1.2.2血清总胆固醇

1.2.3血清甘油三酯

1.2.4血清高密度脂蛋白胆固醇

1.2.5血清低密度脂蛋白胆固醇

1.3 人体试食试验

1.3.1血清总胆固醇

1.3.2血清甘油三酯

1.3.3血清高密度脂蛋白胆固醇

1.3.4. 血清低密度脂蛋白胆固醇

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必测项目。

2.2 根据受试样品的作用机制，可在动物实验的两个动物模型中任选一项。

2.3 根据受试样品的作用机制，可在人体试食试验的三个方案中任选一项。

2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验：

3.1.1混合型高脂血症动物模型

辅助降低血脂功能结果判定：模型对照组和空白对照组比较，血清甘油三酯升高，血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇升高，差异均有显著性，判定模型成立。（1）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低，且任一剂量组血清甘油三酯降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低血脂功能动物实验结果阳性。（2）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清甘油三酯不显著高于模型对照组，各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低血清胆固醇功能动物实验结果阳性。（3）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清甘油三酯降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇不显著高于模型对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低血清甘油三酯功能动物实验结果阳性。

3.1.2高胆固醇血症动物模型

模型对照组和空白对照组比较，血清总胆固醇（TC）或低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高，血清甘油三酯（TG）差异无显著性，判定模型成立。各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低，差异有显著性，并且各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）不显著低于模型对照组，血清甘油三酯不显著高于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低血清胆固醇功能动物实验结果阳性。

3.2 人体试食试验

指标判定标准：

有效：TC 降低>10％；TG 降低>15％；HDL-C 上升>0.104mmol/L。

无效：未达到有效标准者。

3.2.1辅助降低血脂功能结果判定

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇降低，差异均有显著性，同时血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组总有效率显著高于对照组，可判定该受试样品辅助降低血脂功能人体试食试验结果阳性。

3.2.2辅助降低血清胆固醇功能结果判定

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇降低，差异均有显著性，同时血清甘油三酯不显著高于对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组血清总胆固醇有效率显著高于对照组，可判定该受试样品辅助降低血脂功能人体试食试验结果阳性。

3.2.3辅助降低甘油三酯功能结果判定

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清甘油三酯降低，差异有显著性，同时血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇不显著高于对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组血清甘油三酯有效率显著高于对照组，可判定该受试样品辅助降低甘油三酯功能人体试食试验结果阳性。
辅助降低血脂功能检验方法 Method for the Assessment of Assisting Blood Lipids Reduction Function

根据血脂异常的类型，辅助降低血脂功能按照受试物作用机制的不同，设立分类的动物试验。

动物试验：分成二种情况：

1. 混合型高酯血症动物模型

2. 高胆固醇血症动物模型

人体试食试验：根据试验的结果，分三种情况分别进行判定：

1. 辅助降低血脂功能

2. 辅助降低血清胆固醇功能

3. 辅助降低甘油三酯功能

1 动物实验检验方法

1.1 混合型高脂血症动物模型

1.1.1原理

用含有胆固醇、蔗糖、猪油、胆酸钠的饲料喂养动物可形成脂代谢紊乱动物模型，再给予动物受试样品，可检测受试样品对高脂血症的影响，并可判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响。

1.1.2仪器及试剂

解剖器械、分光光度计，自动生化分析仪，胆固醇、胆酸钠、血清总胆固醇（TC）、

甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒。

1.1.3动物选择及饲料

1.1.3.1 健康成年雄性大鼠，适应期结束时，体重200±20g，首选SD大鼠，每组8－12只。

1.1.3.2 模型饲料

在维持饲料中添加20.0％蔗糖、15％猪油、1.2％胆固醇、0.2％胆酸钠，适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉等。除了粗脂肪外，模型饲料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、钙：磷均要达到维持饲料的国家标准。

1.1.4剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组、空白对照组和模型对照组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间为30天，必要时可延长至45 天。

1.1.5实验步骤

1.1.5.1适应期：于屏障系统下大鼠喂饲维持饲料观察5－7天。

1.1.5.2造模期

按体重随机分成2组，10只大鼠给予维持饲料作为空白对照组，40只给予模型饲料作为模型对照组。每周称量体重1次。

模型对照组给予模型饲料1－2周后，空白对照组和模型对照组大鼠不禁食采血（眼内眦或尾部），采血后尽快分离血清，测定血清TC、TG、LDL-C 、HDL-C水平。根据TC水平将模型对照组随机分成4组，分组后空白对照组和模型对照组比较TC、TG、LDL-C 、HDL-C差异均无显著性。

1.1.5.3受试样品给予

分组后，三个剂量组每天经-口给予受试样品，空白对照组和模型对照组同时给予同体积的相应溶剂，空白对照组继续给予维持饲料，模型对照组及三个剂量组继续给予模型饲料，并定期称量体重，于实验结束时不禁食采血，采血后尽快分离血清，测定血清TC、TG、LDL-C 、HDL-C水平。

1.1.6观察指标：TC、TG、LDL-C 、HDL-C。

1.1.7数据处理和结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，

36F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

动物实验结果判定：

辅助降低血脂功能结果判定：模型对照组和空白对照组比较，血清甘油三酯升高，血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇升高，差异均有显著性，判定模型成立。（1）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低，且任一剂量组血清甘油三酯降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低血脂功能动物实验结果阳性。（2）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清甘油三酯不显著高于模型对照组，各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低胆固醇功能动物实验结果阳性。（3）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清甘油三酯降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇不显著高于模型对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低甘油三酯功能动物实验结果阳性。

1.1.8注意事项

1.1.8.1 在建立动物模型中，可因动物品系、饲养管理而影响模型的建立。

1.1.8.2 保证维持饲料的各种营养成分，必要时需进行检测，除了粗脂肪外，模型饲料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、钙：磷均要达到维持饲料的国家标准。

1.1.8.3 模型饲料喂养期间，模型组血中胆固醇水平比较稳定，甘油三酯水平会逐渐恢复正常水平，故模型饲料给予时间不能超过8周。

1.2 高胆固醇血症动物模型

1.2.1原理

用含有胆固醇、猪油、胆酸钠的饲料喂养动物可形成高胆固醇脂代谢紊乱动物模型，再给予动物受试样品，可检测受试样品对高胆固醇脂血症的影响，并可判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响。

1.2.2仪器及试剂

解剖器械、分光光度计，自动生化分析仪，胆固醇、胆酸钠、血清总胆固醇（TC）、

甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒。

1.2.3动物选择及饲料

1.2.3.1 大鼠模型：健康成年雄性大鼠，适应期结束时，体重200±20g，首选SD 种大鼠，每组8－12只。

金黄地鼠模型：健康成年雄性金黄地鼠，适应期结束时，体重100±10g，每组8－12只。

1.2.3.2 模型饲料

大鼠模型：在维持饲料中添加1.2％胆固醇、0.2％胆酸钠、3-5％猪油，适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉等。除了粗脂肪外，模型饲料的其它质量指标均要达到维持饲料的国家标准。

金黄地鼠模型：在维持饲料中添加0.2％胆固醇，其余同大鼠模型。

1.2.4剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组、空白对照组和模型对照组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间为30天，必要时可延长至45天。

1.2.5实验步骤

1.2.5.1适应期：于屏障系统下动物喂饲维持饲料观察5－7天。

1.2.5.2造模期：

按体重随机分成2组，10只动物给予维持饲料作为空白对照组，40只给予模型饲料作为模型对照组。每周称量体重1次。

模型对照组给予模型饲料1-2周后，空白对照组和模型对照组动物不禁食采血（眼内眦或尾部），采血后尽快分离血清，测定血清TC、TG、LDL-C 、HDL-C水平。根据TC水平将模型对照组随机分成4组，分组后空白对照组和模型对照组比较TC、TG、LDL-C 、HDL-C差异均无显著性（P>0.05）。

1.2.5.3受试样品给予

分组后，三个剂量组每天经口给予受试样品，空白对照组和模型对照组同时给予同体积的相应溶剂，空白对照组继续给予维持饲料，模型对照组及三个剂量组继续给予模型饲料，并定期称量体重，于实验结束时不禁食采血，采血后尽快分离血清，测定血清TC、TG、LDL-C 、HDL-C水平。

1.2.6观察指标：TC、TG、LDL-C 、HDL-C。

1.2.7数据处理和结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，

36F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

动物实验结果判定：

辅助降低胆固醇功能结果判定：模型对照组和空白对照组比较，血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇升高，差异有显著性，血清甘油三酯差异无显著性，判定模型成立。各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低，差异有显著性，并且各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，血清甘油三酯不显著高于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低胆固醇功能动物实验结果阳性。

1.2.8注意事项

1.2.8.1 在建立动物模型中，可因动物品系、饲养管理而影响模型的建立。

1.2.8.2 保证维持饲料的各种营养成分，必要时需进行检测。

2 人体试食试验检验方法

2.1 受试者纳入标准

2.1.1在正常饮食情况下，检测禁食12-14小时后的血脂水平，半年内至少有两次血脂检测，血清总胆固醇在5.18-6.21mmol/L，并且血清甘油三酯在1.70-2.25mmol/L，可作为辅助降低血脂功能备选对象；血清甘油三酯在1.70-2.25mmol/L，并且血清总胆固醇≦6.21mmol/L，可作为辅助降低甘油三酯功能备选对象；血清总胆固醇在5.18-6.21mmol/L，并且血清甘油三酯≦2.25mmol/L，可作为辅助降低胆固醇功能备选对象，在参考动物实验结果基础上，选择相应指标者为受试对象。

2.1.2原发性高脂血症。

2.1.3获得知情同意书，自愿参加试验者。

2.2 排除受试者标准

2.2.1年龄在18 岁以下或65 岁以上者。

2.2.2妊娠或哺乳期妇女，过敏体质或对本受试样品过敏者。

2.2.3合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病，精神病患者。

2.2.4近两周曾服用调脂药物，影响到对结果的判断者。

2.2.5住院的高血脂症者。

2.2.6未按规定食用受试样品，或资料不全，影响功效或安全性判断者。

2.3 受试样品的剂量和使用方法

根据受试样品推荐量和推荐方法确定。

2.4 试验设计及分组要求

采用自身和组间两种对照设计。根据随机盲法的要求进行分组。按受试者血脂水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、饮食等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50 例。试食组服用受试样品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照。试验周期45天，不超过6个月。

2.5 观察指标

2.5.1安全性指标

2.5.1.1 一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）

2.5.1.2 血、尿、便常规检查

2.5.1.3 肝、肾功能检查

2.5.1.4 胸透、心电图、腹部B 超检查（仅在试验开始前进行）

2.5.2功效性指标

2.5.2.1 血清总胆固醇（TC）水平及降低百分率、甘油三酯（TG）水平及降低百分率、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平及上升幅度、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。

2.5.2.2 功效判定标准

有效：TC 降低>10％；TG 降低>15％；HDL-C 上升>0.104mmol/L。

无效：未达到有效标准者。

观察血清总胆固醇（TC）有效率、甘油三酯（TG）有效率、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）有效率及总有效率。

2.6 数据处理和结果判定

凡自身对照资料可以采用配对t 检验，两组均数比较采用成组t 检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t 检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验；方差齐方但变异系数太大（如CV>50％）的资料应用秩和检验。有效率及总有效率采用X2 检验进行检验。四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40 但出现理论数等于或小于1 时，应改用确切概率法。

2.6.1辅助降低血脂功能结果判定：

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇降低，差异均有显著性，同时血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组总有效率显著高于对照组，可判定该受试样品辅助降低血脂功能人体试食试验结果阳性。

2.6.2辅助降低血清胆固醇功能结果判定：

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇降低，差异均有显著性，同时血清甘油三酯不显著高于对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组血清总胆固醇有效率显著高于对照组，可判定该受试样品辅助降低血脂功能人体试食试验结果阳性。

2.6.3辅助降低甘油三酯功能结果判定：

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清甘油三酯降低，差异有显著性，同时血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇不显著高于对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组血清甘油三酯有效率显著高于对照组，可判定该受试样品辅助降低甘油三酯功能人体试食试验结果阳性。

改善缺铁性贫血功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目

1.1 动物实验

1.1.1体重

1.1.2血红蛋白

1.1.3红细胞比积/红细胞游离原卟啉

1.2 人体试食试验

1.2.1血红蛋白

1.2.2血清铁蛋白

1.2.3红细胞游离原卟啉/红细胞运铁蛋白饱和度

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

2.2 针对儿童的人体试食试验，只测血红蛋白和红细胞内游离原卟啉。

2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验：血红蛋白指标阳性，红细胞游离原卟啉/红细胞压积二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果为阳性。

3.2 人体试食试验

3.2.1针对改善儿童缺铁性贫血功能的，血红蛋白和红细胞内游离原卟啉二项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用。

3.2.2针对改善成人缺铁性贫血功能的，血红蛋白指标阳性，血清铁蛋白、红细胞内游离原卟啉/血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用。
改善缺铁性贫血功能检验方法 Method for the Assessment of Improving Nutritional Anaemia Function

1.动物实验

1.1 原理

用低铁饲料喂饲动物可形成实验性缺铁性贫血模型，再给予受试样品，观察其对血液细胞学、血液生化学等指标的影响，可判定该受试样品对改善动物缺铁性贫血的作用。

1.2 实验动物

健康初断乳大鼠，单一性别，每组大鼠8－12只。

1.3 低铁饲料

配方：

成分	添加量 g/kg
玉米淀粉	529.5
蛋清蛋白*	200.0
蔗糖	100.0
玉米油（无添加剂）	70.0
纤维素	50.0
混合矿物盐(AIN-93G-MX)	35.0
混合维生素(AIN-93G-VX)	10.0
L-胱氨酸氯化胆碱	3.0 2.5

* 亦可使用EDTA处理的酪蛋白

AIN-93G混合矿物盐配方

矿物质	添加量 g or mg/kg mix
Calcium carbonate anhydrous	357.00
Potassium phosphate monobasic	196.00
Potassium citrate, tripotassium monohydrate	70.78
Sodium chloride	74.00
Potassium sulfate	46.60
Magnesium oxide	24.00
Zinc carbonate	1.65
Sodium meta-silicater9H₂O	1.45
Manganous carbonate	0.63
Cupric carbonate	0.30
Chromium potassium sulfater12H₂O	0.275
Boric acid (17.5% B), mg	81.50
Sodium fluoride (45.24% F), mg	63.50
Nickel carbonate (45% Ni), mg	31.80
Lithium chloride (16.38% Li), mg	17.40
Sodium selenate anhydrous(41.79% Se), mg	10.25

AIN^-93G混合维生素配方

维生素	添加量 g/kg mix
Nicotinic acid	3.000
Ca pantothenate	1.600
Pyridoxine-HCl	0.700
Thiamin-HCl	0.600
Riboflavin	0.600
Folic acid	0.200
Biotin	0.020
Vitamin B-12 (cyanocobalamin) (0.1% in mannitol)	2.500
Vitamin E (all-rac-a-tocopheryl acetate)2 (500 IU/g)	15.000
Vitamin A (all-trans-retinyl palmitate)2 (500,000 IU/g)	0.800
Vitamin D-3 (cholecalciferol) (400,000 IU/g)	0.250
Vitamin K-1 (phylloquinone)	0.075
Powdered sucrose	974.655

1.4剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个低铁对照组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组（硫酸亚铁或乳酸亚铁，剂量为2 ppm或2 mg/(kgbw)，以Fe元素计）。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.5 实验步骤

1.5.1建立缺铁性贫血大鼠模型

选用健康断乳大鼠在实验环境下适应3－5天后饲予低铁饲料及去离子水（或双蒸水），采用不锈钢笼及食罐，同时，采用剪尾取血法放血，5天一次，每次0.3－0.5ml。实验过程中避免铁污染。自第3周开始每周选取部分大鼠采尾血测Hb，如多数动物Hb低于100g/L时，测定全部大鼠的体重及Hb。

1.5.2恢复实验

选取Hb<100g/L的大鼠作为实验动物，根据贫血大鼠Hb水平和体重将其随机分为低铁对照组和三个实验组，各组均继续饲予低铁饲料，低铁对照组给予相应溶剂，实验组分别给予不同剂量的受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，测定体重及各项血液学指标。

1.6 观察指标

体重、血红蛋白、红细胞比积/红细胞内游离原卟啉

1.6.1血红蛋白测定（氰化高铁法）

消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白。

1.6.1.1 吸光系数法

1.6.1.1.1 原理

血红蛋白（haemoglobin，Hb）被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再与氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白（红色），氰化高铁血红蛋白（红色）极为稳定，在540nm波长下，摩尔吸光系数为44000，据此，用分光光度法测其光密度，运用吸光系数作血红蛋白的定量测定。

1.6.1.1.2 仪器

分光光度计。

10微升微量吸管。

1.6.1.1.3 试剂

称取碳酸氢钠（NaHCO₃，AR）140毫克、铁氰化钾200毫克、氰化钾50毫克，用水溶解并稀释到1000毫升。贮存於棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱（4℃）保存，至少可稳定数月到1年。

1.6.1.1.4 实验步骤

1.6.1.1.4.1 取试剂2.5毫升於5毫升带盖试管中，加入10微升血液，混匀后，放置15分钟。

1.6.1.1.4.2 选用0.5厘米光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以736，即为血红蛋白浓度（g/L）。

计算公式如下：
C_t =

Ct=待测的血红蛋白（g/L）浓度。

= 氰化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。

251 = 测定时血液的稀释倍数（血10μL加入试剂2.5mL中）

44000 = 氰化高铁血红蛋白的摩尔吸光系数

0.5 = 比色杯的光径

64458 = 血红蛋白的分子量

1.6.1.1.5 注意事项

1.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。

1.6.1.1.5.2 仪器因摩尔吸光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算，故此法要求所用的仪器性能要符合要求（如仪器的波长准确与否，以及灵敏度及线性等），否则将直接影响测定的结果。

1.6.1.1.5.3 仪器在使用前最好应以WHO规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。参考液最好选用ICSH（国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（荷兰国立公共卫生研究院）制作的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氰化高铁血红蛋白标准液。

1.6.1.2 标准曲线法

1.6.1.2.1 原理

血红蛋白（hemoglobin，Hb）在铁氰化钾和氰化钾的作用下生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红色），其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。用分光光度计在540nm波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可得Hb的浓度。

1.6.1.2.2 仪器

10μL血色素吸管（或定量毛细管）

5mL或10mL带盖试管

分光光度计

1.6.1.2.3 试剂

称取碳酸氢钠（NaHCO₃，AR）140mg、铁氰化钾200mg、氰化钾50mg，用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，贮存于棕色试剂瓶内，保存于4℃冰箱可稳定至1年。

1.6.1.2.4 实验步骤

吸取2.5mL试剂于5mL带盖试管中，用10μL血色素吸管（或定量毛细管）取大鼠尾血或静脉血10μL放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15min。选用0.5cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质的血红蛋白含量(g/L)，计算参考物质的回收率。

1.6.1.2.5 注意事项

1.6.1.2.5.1 不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。

1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系数方法计算血红蛋白的含量，因为仪器的波长准确与否仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。

1.6.1.2.5.3 每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中、高3个浓度）。

1.6.1.3 数据处理及结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

受试样品组与对照组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度平均达到10g/L以上，判定该实验结果阳性。

1.6.2红细胞内游离原卟啉测定

1.6.2.1 原理

血红蛋白的合成过程中，幼红细胞中的原卟啉在血红素合成酶的作用下与铁结合，当铁供应不足时，红细胞内的原卟啉乃以游离形式累积起来超过正常水平。因此，检测红细胞内游离原卟啉（Free erythrocyte proloporphyrin， FEP）的含量是检查缺铁性红细胞生成的有效方法。

血液样品经生理盐水稀释后，分别以乙酸乙酯：乙酸混合液（4:1）和0.5N盐酸提取分离血中游离原卟啉，在一定波长下测定其原卟啉的荧光强度而定量。

1.6.2.2 仪器

1.6.2.2.1 荧光分光光度计或930型荧光光度计。

1.6.2.2.2 离心机。

1.6.2.2.3 混旋器。

1.6.2.3 试剂

1.6.2.3.1 肝素抗凝剂一支12500单位的肝素以0.9%生理盐水稀释至25mL（1mL=500单位）。

1.6.2.3.2 5 %（W/V）硅藻土生理盐水悬浊液称取5g硅藻土加0.9%生理盐水至100mL。

1.6.2.3.3 4:1乙酸乙酯和乙酸混合液。

1.6.2.3.4 0.5N HCl。

1.6.2.3.5 原卟啉标准液。

1.6.2.3.5.1 原卟啉标准贮备液（50mg/L）：称取5mg原卟啉，加4mL无水乙醇使之溶解，以1.5N HCl稀释至100mL。

1.6.2.3.5.2 原卟啉标准中间液（1.0mg/L）：取2mL原卟啉贮备液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到100mL。

1.6.2.3.5.3 原卟啉标准应用液（0.1mg/L）：取1mL原卟啉中间液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到10mL。

1.6.2.4 实验步骤

试剂样品管空白管标准管

肝素（mL） 0.10 0.10 0.10

全血（mL） 0.02 — —

水（mL） — 0.02 0.02

5%硅藻土悬浊液（mL） 0.15 0.15 0.15

原卟啉标准应用液（mL） — — 0.5

乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液（mL） 4 4 3.5

注：按上表依次加入各种试剂，在加入乙酸乙酯与乙酸混合液前，用混旋器混合已加入的混合液，然后边混合边加入乙酸乙酯与乙酸混合液。

离心15分钟，将各管上清液分别倒入10mL比色管中，每管加4mL 0.5N盐酸，振摇5分钟静止使之分层，将上层溶剂抽出弃去，测定盐酸液的荧光强度（30分钟内比色）。

1.6.2.5 荧光测量

1.6.2.5.1 若使用日立MPF-4型荧光分光光度计测定条件为激发波长为403nm，狭缝10nm；发射波长为605nm，狭缝为5nm，液槽为1cm厚石英槽。

1.6.2.5.2 若使用国产930型荧光光度计测试，条件为激发滤光片420，荧光滤片550，灵敏度 1×500，满度开关开至最大，液槽为1cm厚石英槽，检出灵敏度为0.01?g/4mL。在不同量原卟啉（0?g，0.01?g，0.03?g，0.05?g，0.07?g，0.1?g）呈线性关系。

1.6.2.6 计算

样品荧光强度-空白荧光强度 100

血中原卟啉含量（?g/L全血） = ───────────────×标准管原卟啉含量（?g）×─────────×10

标准管荧光强度-空白荧光强度样品取样量(mL)

1.6.2.7 数据处理及结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

受试样品组与对照组比较，红细胞内游离原卟啉降低经统计处理差异有显著性，即可判定该实验结果阳性。

1.6.2.8 注意事项

1.6.2.8.1 荧光强度随时间延长而逐渐衰退，但30分钟内基本稳定。

1.6.2.8.2 加乙酸乙酯-乙酸混合液时，一定要边混合边加入，否则影响测定结果。

1.6.2.9 滤纸法测定：

将滴有20微升血点全部剪下放入试管中，同时取同样大小空白滤纸放入标准管和空白管中，各管均加入5%硅藻土悬浊液0.2亳升，振荡后放置过夜，以下步骤同直接法。

计算： FEP（微克/100毫升全血）=C/B×A/D×100

A=标准管原卟啉含量（0.02毫克）

B=标准管荧光强度-空白管荧光强度

C=血样荧光强度-空白管荧光强度

D=取样量

1.6.3红细胞压积测定：使用全自动血细胞分析仪进行。数据处理及结果判定同“1.6.2.7”。

1.7 数据处理和结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

受试样品组与低铁对照组相比，若血红蛋白差异有显著性，且其前后平均升高幅度达到10g/L以上，同时，受试样品红细胞内游离原卟啉或红细胞压积与低铁对照组相比差异有显著性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果阳性。

1.8 注意事项

本项实验关键在于贫血模型的建立。低铁饲料含铁量最好控制在9mg/Kg以下，所用试剂应为分析纯，动物饮用水应为去离子水或双蒸水，采用不锈钢笼具，所用器皿应用10%硝酸溶液处理。实验过程中严防外来铁的污染及彼此交叉污染。

2 人体试食试验

2.1 受试者纳入标准

受试者为小细胞低色素贫血，且有明确的缺铁原因和临床表现的成人和儿童。

2.1.1成人纳入标准：男性 Hb 80g/L－130g/L，女性 Hb 80g/L－120g/L。

2.1.2儿童纳入标准：≤6岁儿童 Hb 70g/L－110g/L；7－18岁青少年80g/L－120g/L。

2.2 受试者排除标准

2.2.1合并有心、脑血管、肝、肾、消化道等严重疾病及精神病患者。

2.2.2过敏体质或对该受试样品过敏者。

2.2.3严重贫血患者。

2.2.4短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。

2.2.5未按标准服用受试样品、资料不全影响功效或安全性判断者。

2.3 试验设计及分组要求

采用自身和组间两种对照设计。按受试者的血红蛋白水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如性别、年龄、经济状况等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。

2.4 受试样品的剂量和使用方法

试食组按推荐服用方法、服用量服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照，也可服用具有同样作用的阳性物。受试样品给予时间30天，必要时可延长至120天。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。

2.5 观察指标

2.5.1安全性指标

2.5.1.1 一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）

2.5.1.2 血、尿、便常规检查

2.5.1.3 肝、肾功能检查（儿童受试者不测定此项）

2.5.1.4 腹部B超、胸透、心电图检查（各项指标在试验前检查一次，儿童受试者不测此项）

2.5.2膳食调查

于试验开始前、结束前进行三天的询问法膳食调查，观察饮食因素对试验结果的影响。

2.5.3症状观察

食欲不振、乏力、烦燥、头晕、眼花、精神不集中、心慌、气短等。

2.5.4功效性指标

儿童观察指标：血红蛋白、红细胞内游离原卟啉

成人观察指标：血红蛋白、血清铁蛋白、血清运铁蛋白饱和度/红细胞内游离原卟啉

2.5.4.1 血红蛋白：见1.6.1。

2.5.4.2 血清铁蛋白测定（放射免疫法）：

2.5.4.2.1 原理

人血清中的铁蛋白（SF）与加入的¹²⁵I 标记的SF竞争性地与抗铁蛋白抗体结合。用第二抗体分离结合部分，分别测定总放射性与沉淀物放射性计数。依据标准SF试剂作出标准曲线，从而可在曲线上查出相应样品血清的SF浓度。

*SF+Ab ←→ *SF－Ab+*SF

+

SF

↑↓

SF－Ab

+

SF

*SF：标记的铁蛋白 SF：未标记的铁蛋白 Ab：抗铁蛋白抗体

2.5.4.2.2 仪器

离心机、-射线计数仪。

2.5.4.2.3 试剂

¹²⁵I－血清铁蛋白放射免疫分析试剂盒.。

2.5.4.2.4 操作步骤

2.5.4.2.4.1 操作步骤：铁蛋白测定操作程序和试剂用量（mL）

（见下表）

2.5.4.2.4.2绘制标准曲线

以各标准管的B/ B₀ %作纵座标，标准铁蛋白浓度为横座标（对数边）作标准曲线。样品或质控由B/ B₀ %值从曲线上查到相应的含量。

组别名称	标准曲线组				待测管
组别名称	（T）总计数值	（NBS）非特异管	（B₀）零标准管	（B）标准管	待测管
温育液		0.2	0.1
铁蛋白标准				0.1
待测血样或质控					0.1
铁蛋白抗体			0.1	0.1	0.1
¹²⁵I－铁蛋白	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
充分摇匀，37℃，温育1.0小时
分离试剂		0.5	0.5	0.5	0.5
充分摇匀，室温15分钟
3500转／分，离心15分钟，弃上清液，测沉淀计数

2.5.4.2.4.3结果计算

非特异结合率：

NBS（%） =×100%

零管结合率：

B₀/ T（%） =×100%

标准管（样品、质控）结合率：

B／B₀（%） =×100%

2.5.4.2.4.4 注意事项

本实验为抗原抗体结合反应，操作时要注意防止可引起抗原、抗体失活的因素（如高温、冰冻等）。

测定时，要防止液体溅出，以免造成同位素污染，使本底值增高。

离心后，抽去上清液时勿将平铺在管底的免疫复合物吸起，否则测定结果不准确。

非特异管、零管是为鉴定试剂是否符合规定而设立的。

血清铁蛋白浓度也可用酶联免疫吸附法测定。具体测定方法按相应试剂盒说明书进行。

2.5.4.3 血清运铁蛋白饱和度测定

2.5.4.3.1原理

血清中加入过量的铁，使血清中的运铁蛋白全部与铁结合，达到饱和，过剩的铁用碳酸镁吸附除去，然后按测血清铁的方法，测定总结合的铁量，即为总铁结和力。从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。

2.5.4.3.2血清铁测定

血清铁（S1）是指存在于血清中与血清运铁蛋白结合的铁，它以高铁的形式附着在血清pl球蛋白的转递蛋白上，成人正常值为50－184?g/100mL。缺铁性贫血时常低于50?g/100mL，当血红蛋白浓度降低不明显时，血清铁已减少，被认为是早期缺铁性贫血诊断依据之一。

2.5.4.3.2.1 铬天青B铵盐比色法

铬天青B铵盐作为显色剂测血清铁，比过去多采用的联吡啶等作为显色剂有较高的灵敏度，其克分子吸光系数在630nm波长下为1.68×10⁵L·mol^-1·cm^-1。可大大减少样品血清量，方法简便，准确。

2.5.4.3.2.1.1原理

Fe³／Fe²与铬天青B（CAB）和十六烷基三甲基溴化铵（CTMA）反应，形成三元胶囊状络合物使试剂颜色加深，其颜色加深程度与血清铁含量成正比，在pH为4.6－5.5，波长为630nm时，有最大吸收峰，利用柠檬酸船为铁的掩蔽剂，样品为自身空白，不需除蛋白，即可测出血清铁的含量。

2.5.4.3.2.1.2试剂

2.5.4.3.2.1.2.1缓冲溶液 pH4.75，取25g无水醋酸钠，110g氯化钠，8mL冰醋酸，用蒸馏水定容1000mL。用酸度计测pH应为4.75。

2.5.4.3.2.1.2.2 显色剂

2.5.4.3.2.1.2.2.1 0.1％铬天青B铵盐溶液（A液）：取0.1g铬天青B铵盐，定容于l00mL蒸馏水中，放在棕色瓶中可在室温下保存1个月。

2.5.4.3.2.1.2.2.2 0.3％十六烷基三甲基溴化铵（B液）：取十六烷基三甲基溴化铵0.3g，用蒸馏水定容至100mL。

2.5.4.3.2.1.2.2.3 显色剂应用液：取90mL B液，60mL A液，小心混匀，用缓冲溶液定容至1000mL，放在棕色瓶内可保存1个月。

2.5.4.3.2.1.2.3 掩蔽剂：称17.0g柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O），35.0g柠檬酸钠（Na₃C₆H₅O₇·H₂O），约加50mL蒸馏水加热助溶，冷却后定容至l00mL。

2.5.4.3.2.1.2.4 铁标准液

2.5.4.3.2.1.2.4.1 贮备液：3mmol／L，取1.176g硫酸亚铁铵（6分子结晶水）至少量蒸馏水中，加50mL浓硝酸混匀反应10分钟，用蒸馏水定容至1000mL。

2.5.4.3.2.1.2.4.2 工作液：30?mol／L，取10mL贮备液，用蒸馏水定容至1000mL。

2.5.4.3.2.1.3 方法

按下表加入各种试剂。

	样品管	标准管	空白1	空白2	空白3
血清（mL ）	0.1			0.1
Fe标（30?mol／L）		0.1
蒸馏水（mL ）			0.1		0.1
显色剂应用液（mL）	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
隐蔽剂（mL ）				0.1	0.1

混匀，放置20分钟，在721型分光光度计上，波长630nm，以空白管调零点记录光密度。

注：①样品管和标准管以空白1调0点；

②空白管2以空白3调0点。

2.5.4.3.2.1.4 计算

样品管光密度—空白2管光密度

血清铁浓度（?mol／L） = × 30

标准管光密度

样品管光密度—空白2管光密度

或血清铁浓度（?g／100mL）= × 167.55

标准管光密度

2.5.4.3.2.1.5 注意事项

2.5.4.3.2.1.5.1 要求所用器皿用2N盐酸浸泡过夜，试剂纯度为分析纯以上，所用蒸馏水为双蒸水或去离子水。

2.5.4.3.2.1.5.2 缓冲液pH对结果影响较大，测定时pH应保证在4.70－4.80之间。

2.5.4.3.2.1.5.3 严格限制波长的选择（需经校下），血清样品在607－609nm之间有一个杂质吸收峰。

2.5.4.3.2.2 原子吸收光谱法

用原子吸收光谱法测定生物样品中微量元素的含量具有操作简便、快速、灵敏度较高的优点，故被广泛应用。

2.5.4.3.2.2.1试剂

2.5.4.3.2.2.1.1混合酸消化液： 4份硝酸，1份高氯酸混合即成。

2.5.4.3.2.2.1.2铁标准溶液

2.5.4.3.2.2.1.2.1 铁标贮备液：取1.0000g纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1N盐酸稀释到1000mL，移入聚乙烯塑料瓶内，存放在4℃冰箱，1mL含1mg铁。

2.5.4.3.2.2.1.2.2铁标工作液：取10mL贮备液，用0.1N盐酸定容至l00mL，lmL=l00?g铁。

2.5.4.3.2.2.2 操作

2.5.4.3.2.2.2.1 样品收集及处理

取静脉血2mL于盛有l0mg草酸钾的5mL试管中（于每试管中加入0.2mL5％草酸钾，置烘箱中烤干即成），离心（3000转／分）15分钟。将分离出的血浆吸入另一带盖小试管中，备用。

2.5.4.3.2.2.2.2 消化

取1.0mL血浆，于100mL高型烧杯中，约加3mL混合酸消化液，上盖表皿，放置数小时或过夜，在沙浴电热板上徐徐加热煮沸，在冒白色浓烟激烈作用后溶液呈无色或淡黄色。反应终了，取下烧杯（若酸用量不够，最后可出现溶液变黑现象，此时可再加2 mL混合酸消化液继续消化直至五色）。冷却后用10－20mL去离子水冲洗表皿和杯壁，除去表皿继续加热，直到再度冒白色浓烟，待溶液体积接近蒸干，残留酸量不超过l mL，取下冷却，用蒸馏水稀释至3mL。

2.5.4.3.2.2.2.3 测定

吸取0.0mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，5.0mL铁标准应用液，用0.1N盐酸定容至100mL，混合，各容量瓶中每mL分别相当于0?g，0.5?g，1?g，2?g，3?g，5?g铁。

将处理后的样液，试剂空白，铁标系列溶液分别导入火焰进行测定，测定条件（Pekin-Elener403型原子吸收分光光度计）：波长248.3nm；空心阴极灯电流：30mA，狭缝宽0.2mm，空气流量13.51／min，乙炔流量：5.21／分。以铁含量对应浓度吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线求得样品铁含量。

2.5.4.3.2.2.2.4 计算

（A₁－A₂）×V

X＝ × 100

m

式中：X─ 血浆中铁的含量（?g／100mL血清）。

A₁─测定用样品液中铁的含量（mg／L）。

A₂─测定空白液中铁的含量（mg／L）。

V─样品处理液定容总体积（mL）。

m─ 血浆取样量（mL）

2.5.4.3.3总铁结合量测定

2.5.4.3.3.1试剂

2.5.4.3.3.1.1 铁标准液

2.5.4.3.3.1.1.1 铬天青B铵盐法

2.5.4.3.3.1.1.1.1贮备液：（3mmol/L）取1.176g硫酸亚铁铵（6分子结晶水）置蒸馏水中，加50mL浓硝酸混匀反应10分钟，用蒸馏水定容至1000mL。

2.5.4.3.3.1.1.1.2 工作液：（30?mol/L）取10mL贮备液，用蒸馏水定容至1000mL。

2.5.4.3.3.1.1.2 原子吸收分光光度法

2.5.4.3.3.1.2.2.1贮备液：取1.0000g纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1N盐酸稀释到1000mL，移入聚乙烯塑料瓶内，存放4^oC冰箱，1mL含1mg铁。

2.5.4.3.3.1.2.2.2 工作液：取10mL贮备液，用0.1N盐酸定容至100mL，1mL=100?g铁。

2.5.4.3.3.2 轻质碳酸镁（AR）（或碱式碳酸镁）其质量应符合要求。

2.5.4.3.3.3实验步骤

2.5.4.3.3.3.1 应用铬天青B铵盐方法测总铁结合量取0.1mL血清放入尖底离心管，加60?mol/l铁标准液0.1mL充分混合，室温放置15分钟。再加4－5mg轻质碳酸镁，放置15分钟，混合3－4次。然后以3000转/分离心5－8分钟，取上清液0.1mL按铬天青B铵盐比色法测血清铁的步骤进行操作，计算。

2.5.4.3.3.3.2 原子吸收分光光度法测总铁结合量取1.0mL血清，加铁标准液（20?g/mL）0.5mL，充分混合，放置15分钟。加150mg轻质碳酸镁，充分混匀1分钟以上，放置30分钟，混合3－4次。离心10分钟，取上清液1mL按原子吸收分光光度法测血清铁的操作步骤进行消化，测定，计算。

2.5.4.3.3.4 计算

2.5.4.3.3.4.1 血清总铁结合量可用（mg/100L）表示。

2.5.4.3.3.4.2 未饱和铁量 = 血清总铁结合量－血清铁。

血清铁

血清蛋白运铁蛋白饱和度（％）= ────────── ×100

血清总铁结合量

2.5.4.3.4 数据处理及结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

2.5.4.4 红细胞内游离原卟啉：见1.6.2。

2.5.5 结果判定

受试样品组与对照组比较，血红蛋白升高且平均升高幅度≥10g/L，血清铁蛋白增加，血清运铁蛋白饱和度升高，红细胞游离原卟啉降低，经统计处理差异有显著性，即可分别判定该指标结果阳性。

2.6 数据处理及结果判定：

试验数据为计量资料，可用t检验进行分析。凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t＇检验或秩和检验；但变异系数太大（如CV>50％）的资料应用秩和检验。

结果判定：

改善儿童缺铁性贫血：试验前后自身比较和试验后组间比较，血红蛋白、红细胞内游离原卟啉二项指标差异有显著性；同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度≥10g/L，可判定受试样品具有改善缺铁性贫血功能的作用。

改善成人缺铁性贫血：试验前后自身比较和试验后组间比较，血红蛋白指标差异有显著性；同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度≥10g/L，血清铁蛋白、红细胞内游离原卟啉/血清运铁蛋白饱和度二项指标中一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能。

缓解视疲劳功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1 人体试食试验项目

1.1 分别于试食前后进行眼部症状及眼底检查，血、尿常规检查，肝、肾功能检查，症状询问、用眼情况调查；于试验前进行一次胸透、心电图、腹部B超检查。

1.2 明视持久度

1.3 视力

2 试验原则

2.1 受试样品试食时间为60天。

2.2 所列指标均为必做项目。

2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，症状改善且症状总积分差异有显著性（p<0.05）。

3.2 试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，明视持久度差异有显著性（p<0.05），且平均明视持久度提高大于等于10%。

具备3.1及3.2可判定该受试物具有缓解视疲劳功能。
缓解视疲劳功能检验方法 Method for the Assessment of Alleviating Eye Fatigue Function

1受试者纳入标准

1.1 18岁－65岁的成人。

1.2 长期用眼，视力易疲劳者。

2受试者排除标准

2.1 患有感染性、外伤性眼部疾患者。进行眼部手术不足3个月者。

2.2 患有角膜、晶体、玻璃体、眼底病变等内外眼疾患者。

2.3 患有心血管、脑血管、肝、肾、造血系统等疾病者。

2.4 妊娠或哺乳期妇女、过敏体质患者。

2.5 短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判定者。

2.6 长期服用有关治疗视力的药物，保健品或使用其他治疗方法未能终止者。

2.7 不符合纳入标准，未按规定食用受试物者，或资料不全等影响功效或安全性判断者。

3 试验设计及分组要求

采用自身和组间两种对照设计。根据随机、双盲的要求进行分组，分组时根据症状及视力检查情况，使试食组和对照组的症状及视力水平均衡。同时要考虑年龄、性别等因素，使两组具有可比性。试食试验结束时每组受试者人数不少于50例。

4 受试物的剂量和使用方法

试食组按推荐方法和推荐量服用受试物，对照组服用安慰剂。受试物服用时间为连续60天。

5 观察指标

5.1 安全性指标：

5.1.1血、尿常规检查，体格检查。

5.1.2肝、肾功能检查。

5.1.3胸透或X光片、心电图、腹部B超检查（于试食前检查一次）。

5.2 功效性指标：于试食开始及结束时检查。

5.2.1问卷调查：症状询问、用眼情况。

5.2.2眼科检查：包括眼底检查、视力检查（近视、远视、散光等）。

5.2.3明视持久度（测定方法见附录）。

6 功效判定标准

6.1 症状改善有效率

眼酸痛、眼胀、畏光、视物模糊、眼干涩、异物感、流泪，全身不适8种症状中有3种改善，且其他症状无恶化即判定症状改善。计算两组症状改善例数和两组症状改善有效率。症状改善有效率（%）计算方法为症状改善例数/试食例数×100。将两组症状改善有效率进行统计学检验。

6.2 症状平均积分

计算每位试食者试食前后的症状积分，分别计算两组的平均积分值，并进行统计学检验。
表1 视疲劳症状判定方法（半定量积分法）

症状／积分	0	1分	2分	3分
眼胀	无	偶感眼胀	时有眼胀，休息后好转	经常眼胀，休息后改善
眼酸痛	无	偶感隐痛	时有眼痛	经常眼痛
畏光	无	偶有畏光	时有畏光	经常畏光
视物模糊	无	偶有模糊	时有模糊，休息后缓解	经常模糊，休息后改善
眼干涩	无	偶有干涩	时有干涩	经常干涩
异物感	无	偶有异物感	时有异物感	经常异物感
流泪	无	偶有流泪	时有流泪	经常流泪
与视疲劳相关的全身不适	无	偶有全身不适	时有全身不适	经常全身不适

注：“偶感”是指1－2次／2天；“时有”是指1－3次／天；“经常”是指>3次／天

6.3 视力改善率

为参考指标。以试食后较试食前提高两行为改善，统计两组服用受试物后的视力改善率作为参考指标。参考指标不作为对缓解视疲劳功能是否有效的判定标准。

6.4 明视持久度

试食组自身比较或试食组与对照组组间比较，明视持久度差异有显著性（p<0.05），且平均明视持久度提高大于等于10%为有效。

7 数据处理和统计分析

计量资料可用t检验进行分析。自身对照采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验。对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验。在试食前组间比较差异无显著性的前提下，可进行试验后组间比较。

计数资料可用X2检验。四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论频数等于或小于1时，应改用确切概率法。

8 结果判定

8.1 试食组自身比较或试食组与对照组组间比较，症状改善有效率或症状总积分差异有显著性（p<0.05）。

8.2 试食组自身比较或试食组与对照组组间比较，明视持久度差异有显著性（p<0.05），且平均明视持久度提高大于等于10%。

具备8.1及8.2且视力改善率不明显降低，可判定该受试物具有有助于缓解视疲劳功能的作用。

附录：明视持久度测定方法
明视持久度测定

此法是用于评价视疲劳的一种方法。当人大脑皮质兴奋性降低时，视觉分析功能下降，眼睛注视对象物的过程中，不能明视的时间增加，能明视的时间减少。这种明视时间对注视时间的百分比称为明视持久度，它是综合反映视功能和心理功能的一种指标。

明视持久度的测定方法如下：

在检查表上绘制“品”字形立体方块图，方块每边长1cm，局部照明100 LX－150 LX（可使用专门制作的灯箱）。测定时，检查表与眼睛的距离应按照受试者视物习惯保持在适当距离不动，规定受试者看到“品”字图像视为明视，倒“品”字时为不明视。测定时间为3min。

检查时让受试者手持能断续计时的秒表，检查者发出开始的口令后，受试者立即注视方块中的图案（或打开灯箱开关），同时开动手中的秒表计时。在注视过程中看到倒“品”字时立即按下秒表的暂停开关；看到又呈“品”字图像时再开动秒表，如此反复进行。测定到规定时间3min结束时受试者听到检查者的口令立即停止秒表，这段时间内秒表走过的读数就是受试者看成“品”字图像的总时间，即明视时间。

明视持久度=（明视时间/注视总时间）?100%

测定时应注意场地和照明，还与受试者受试前的用眼程度有关，实验前应注意。
明视持久度测定用“品”字图 对胃粘膜损伤有辅助保护功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目

1.1 动物实验

1.1.1体重

1.1.2胃粘膜大体损伤状况

1.1.3胃粘膜病理损伤积分

1.2 人体试食试验

1.2.1临床症状

1.2.2体征

1.2.3胃镜观察

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

2.2 无水乙醇、消炎痛致急性胃粘膜损伤模型或冰醋酸致慢性胃粘膜损伤模型任选其一进行动物实验。

2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验：实验组与模型对照组比较，大体观察评分与病理组织学检查评分结果均表明胃粘膜损伤明显改善，可判定该受试样品动物实验结果为阳性。

3.2 人体试食试验：试食组与对照组比较，临床症状、体征积分明显减少，胃镜复查结果有改善，可判定该受试样品对胃粘膜有辅助保护功能。
对胃粘膜损伤有辅助保护功能检验方法 Method for the Assessment of Protection of Gastric Mucosa Function

1 动物实验

1.1 原理

在一定时间内给予一定量的受试样品，用对胃粘膜有损伤作用的物质造成急性胃粘膜损伤模型，观察各剂量组胃粘膜的损伤程度；或用对胃粘膜有损伤作用的物质造成慢性胃溃疡模型，在一定时间内给予一定量的受试样品，观察各剂量组胃溃疡的面积和体积，反映受试样品对胃粘膜的保护作用。

1.2 实验动物

选用SD或Wistar 健康大鼠，单一性别，180－220克，每组8－12只。

1.3 实验设计及剂量分组

受试物设三个剂量组，其中一个应为人体推荐量的5倍剂量组，并同时设置正常对照组。不同的损伤模型，还应设置相应的模型对照组。慢性溃疡模型应先造模，手术次日再分组。受试样品给予时间一般为14—30天，必要时可以延长至45天。

1.4 胃粘膜损伤模型

1.4.1急性胃粘膜损伤酒精模型

1.4.1.1 实验动物：选用Wistar或SD健康大鼠，单一性别。

1.4.1.2 实验器材及试剂：解剖器械，游标卡尺，酒精或醋酸，病理制片系统，生物显微镜等。

1.4.1.3 实验方法：动物随机分正常对照组、模型组和受试样品三个剂量组。各剂量组灌胃样品30天后，全部动物严格禁食24小时（不禁水），此期间亦禁止给予受试物。除空白对照外，所有试验组动物给予无水乙醇1.0ml/只，1小时后处死动物，暴露完整胃，结扎幽门，灌注适量10%甲醛溶液，固定20min，然后沿胃大弯剪开，洗净胃内容物，展开胃粘膜，在体视解剖显微镜下或肉眼下用游标卡尺测量出血点或出血带的长度和宽度。因宽度所代表损伤的严重性远较长度大，故双倍积分。其评分标准见表1。
表1 急性酒精损伤肉眼观查评分标准

损伤程度	1分	2分	3分	4分
出血点	1个	-	-	-
出血带长度	1-5mm	6-10mm	10-15mm	>15mm
出血带宽度	1-2mm	>2mm
总积分 = 出血点分值+长度分值+（宽度分值?2）

抗氧化功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目

1.1 动物实验

1.1.1体重

1.1.2脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）

1.1.3蛋白质氧化产物：蛋白质羰基

1.1.4抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶

1.1.5抗氧化物质：还原性谷胱甘肽

1.2 人体试食试验

1.2.1脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）

1.2.2超氧化物歧化酶

1.2.3谷胱甘肽过氧化物酶

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。

2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。

2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。

2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。

3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。

（编辑天健华成）

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