2 方案二：酒精肝损伤模型

2.1 原理

机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢，致使脂肪在肝细胞内沉积。同时乙醇能激活氧分子，产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化及体内还原型谷胱甘肽的耗竭。

2.2 实验动物

成年小鼠或大鼠，单一性别，大鼠（180－220克），每组8-12只，小鼠（18－22克），每组10-15只。

2.3 实验方法和步骤

2.3.1剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个空白对照组和一个模型对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。用无水乙醇（分析纯）造成肝损伤模型，无水乙醇浓度为50％（以蒸馏水稀释），小鼠灌胃量12－14mL/kgBW (折合乙醇的剂量为6000－7000 mg/kgBW)。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

2.3.2 给予受试样品的途径

经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。

2.3.3 实验步骤

每日经口灌胃给予受试样品，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。给予受试样品结束时将模型对照组及各样品组一次灌胃给予50%乙醇12mL/kgBW，空白对照组给蒸馏水，禁食16小时处死动物，进行各项指标的检测及病理组织学检查。

2.3.4 检测指标

      肝组织中丙二醛（MDA）    还原型谷胱甘肽（GSH）

          甘油三酯（TG）的含量。

 

2.4 肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）测定方法

2.4.1 原理

MDA (malondiadehycle) 是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，检测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。MDA与硫代巴比妥酸在酸性条件下共热，形成粉红色复合物，吸收峰在535nm,具此可测得MDA的含量。

2.4.2 仪器与试剂

仪器  721分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器

试剂0.2M乙酸盐缓冲液 PH3.5

          0.2M乙酸溶液    185mL

          0.2M乙酸钠溶液  15mL

1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL

8.1%十二烷基硫酸钠SDS

0.8%硫代巴比妥酸TBA

0.2M磷酸盐缓冲液 PH7.4

0.2M磷酸氢二钠    1920mL

           0.2M 磷酸二氢钾    480mL     

2.4.3 实验步骤

2.4.3.1 样品制备

组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成5％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5～10min，取上清液待测。

2.4.3.2样品测定

 

 

2.4.3.3计算

                              　 B-A            B-A           1

过氧化脂质含量（nmol/mg组织）＝── ×C×K ＝──×40×────    

                              　 F-A            F-A      0.05×1000

 

   

                  B-A             B-A            1           1

过氧化脂质含量 ＝─── ×C×K ＝───×40×─── ×─────── ×100  

(nmol/100mg蛋白质) F-A             F-A           0.05    每克组织蛋白mg

A:  空白管吸光度

B：样品荧吸光度

F：四乙氧基丙烷吸光度

C：四乙氧基丙烷浓度(40nmol/mL)

K：稀释倍数

 

2.4.3.4 数据处理及结果判定

数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

在模型成立的前提下，受试样品组的MDA含量与模型对照组比较，差异有显著性，判定该指标结果阳性。