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  • 功能学评价检验方法-对化学性肝损伤有辅助保护作用检验方法 4
功能学评价检验方法-对化学性肝损伤有辅助保护作用检验方法 4
2.5 肝匀浆还原型谷胱甘肽(GSH)测定方法
2.5.1 原理
GSH和5,5'-二硫对硝基甲酸(DTNB)反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基甲酸阴离子,于423nm波长有最大吸收峰,测定该离子浓度,即可计算GSH的含量。
2.5.2 试剂
2.5.2.1  0.9%生理盐水
2.5.2.2 4%磺基水杨酸溶液
2.5.2.3 0.1mol/L PBS溶液(pH=8.0):
Na2HPO4       13.452g
KH2PO4         0.722g
加蒸馏水至1000mL。
2.5.2.4 0.004%DTNB溶液:称取DTNB 40mg溶于1000mL的0.1mol/L PBS溶液(pH=8.0)中。
2.5.2.5 叠氮纳缓冲液
NaN3
16.25 mg
EDTA-Na2   
 7.44 mg
Na2HPO4
 1.732 g
NaH2PO4  
 1.076 g
加蒸馏水至1000mL,用少量HCl、NaOH调pH7.0,4℃保存。
2.5.2.6 标准溶液:称取还原型GSH 15.4mg,加叠氮纳缓冲液至50mL,终浓度为 1mmol/L,临用前配制。
2.5.3 方法
2.5.3.1 样品测定:取肝脏0.5g加生理盐水5mL充分研磨成细浆(10%肝匀浆),混匀后取浆液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀,室温下3000rpm离心10分钟,取上清液即为样品。
 
 
测定管
空白管
样品
0.5mL
4%磺基水杨酸
0.5mL
DTNB
4.5mL
4.5mL
 
混匀,室温放置10 分钟后,412nm处测定吸光度。
 
2.5.3.2 标准曲线
1
2
3
4
5
6
1mmol/L GSH(mL)
  0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
生理盐水(mL)
0.50
0.45
0.40
0.35
0.20
0.25
DTNB(mL)
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
 4.50
GSH量(mmol/L)
0
100
200
300
400
500
2.5.3.3 计算
样品GSH含量 (mmol /g肝重) = 对应曲线浓度值 (mmol/L) ÷50g/L
 
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