3 肝糖原测定：蒽酮法。

3.1 检测原理

蒽酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。测定其光密度，可以确定糖原的含量。

3.2 仪器和试剂

2.2.1 仪器：721型分光光度计，离心机，扭力天平，匀浆器，振荡器，移液泵，沸水浴，灌胃针头，手术器械，玻璃漏斗，加样器，2mL、5mL、10mL 吸量管，20mL 带塞刻度试管，10mL 带塞离心管。

3.2.2 试剂：5％三氯醋酸（用蒸馏水配）（TCA），葡萄糖标准液，浓硫酸（AR），蒽酮试剂。

蒽酮试剂：溶液中含0.05％的蒽酮，1％的硫脲，用72％的H ₂SO₄配制。配制方法如下：

①72％H ₂SO4配制：烧杯中加入280mL蒸馏水，再加入高纯度的浓硫酸720mL(比重1.84)。

②蒽酮试剂配法：当H₂SO₄ 温度降至80-90℃时放入500mg纯的蒽酮，10g高纯度的硫脲，适当摇动烧杯混匀。冷却后存放于冰箱中，可保存两周。

3.3 实验方法

3.3.1 实验动物  同1.2.3.1

3.3.2 剂量设计和分组

大鼠剂量以人体推荐食用量扩大5倍作为基本剂量，其余同1.3.2。

3.3.3 实验步骤

末次给样后30min处死动物，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg，加入8mL TCA，每管匀浆1min，将匀浆液倒入离心管，以3000转/min 离心15min，将上清液转移至另一试管内。

取1mL上清液放入10mL离心管中（每样品可做两平行管以保证获得可靠结果），每管加入95％的乙醇4mL，充分混匀至两种液体间不留有界面。用干净塞子塞上，室温下竖立放置过夜（也可选用将试管放在37-40℃水浴3h）。沉淀完全后，将试管于3000转/min 离心15min。小心倒掉上清液并使试管倒立放置10min。

用2mL蒸馏水溶解糖原，加水时将管壁的糖原洗下。如管底的糖原不立即溶解，振荡管子直到完全溶解。

制作试剂空白和标准管：

试剂空白：吸2mL蒸馏水到干净离心管

标准管：吸0.5mL葡萄糖标准液（含100mg/dL葡萄糖）和1.5mL蒸馏水放入同样的管子。

此时将10mL蒽酮试剂用力加入各管，液流（蒽酮试剂）直接进入管子中央，保证充分混合好。从管子中注入蒽酮试剂时起，将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后，将其浸于沸水浴（水浴深度略高于管子液面）15min，然后移到冷水浴，冷却到室温。将管内液体移入比色管，在620nm波长下，用试剂空白管调零后测定吸光度。并根据标准曲线计算出糖原含量，根据所称取的肝脏重量换算成肝糖原含量（以mg/g 肝表示），并进行统计分析。

3.3.3.3  糖原含量计算：

　　　　　　　　　　　　　　　DU          提取液体积

每100克肝组织中糖原的毫克数＝──×0.5×--------------×100×0.9

　　　　　　　　　　　　　　　DS  　      肝组织克数

DU：样品管吸光度

DS：标准管吸光度

0.5：为0.5mL葡萄糖标准液液中的葡萄糖含量。

0.9：为将葡萄糖换算成糖原的系数。

提取液体积：为8ML

肝组织克数：为0.1g

 

3.4 数据处理及结果判定

肝糖原数据为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

若受试样品组肝糖原含量明显高于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。

3.5 注意事项

3.5.1 测定的实验方法均为定量要求，因此所有取样加试剂均需准确。

3.5.2 糖原测定中冷却、加热时间与氧化还原作用有关，因此时间要控制准确。

3.5.3 蒽酮显色剂不稳定，以临用时配制为宜，注意避免采用绒布或被污染的糖类进入蒽酮反应。