4 血乳酸测定

4.1 原理

4.1.1自配试剂测定方法：

在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物，在波长560nm 处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。

4.1.2乳酸盐测定仪测定方法:

检测探头上装有一片三层的膜，其中间层为固定的乳酸盐氧化酶。表面被膜覆盖的探头位于充满缓冲液的样品室内，当样品被注入样品室后，部分底物会渗进膜中；当它们接触到固定酶（乳酸盐氧化酶）时便迅速被氧化，产生过氧化氢。过氧化氢（H₂O₂）继而在铂阳极上被氧化产生电子。当过氧化氢生成率和离开固定膜层的速率达到稳定时便可得到一个动态平衡状态，可用稳态响应表示。电子流与稳态过氧化氢浓度成线性比例，因此与乳酸盐浓度成正比。

4.2 仪器与试剂

4.2.1 仪器：

4.2.1.1 血乳酸测定—自配试剂测定方法：微量吸管，恒温水浴锅，电热水箱，分光光度计。

4.2.1.2 乳酸仪测定方法：乳酸仪，加样器、振荡器。

4.2.2试剂

4.2.2.1 自配试剂测定方法：

4％CuSO₄、浓硫酸(AR)、1％NaF 溶液。

蛋白沉淀剂：按体积分别取一份10％的钨酸钠，一份1/3 mol/L 硫酸，再与28份蒸馏水混合即成。

沉淀剂－NaF 混合液：按体积分别取3份沉淀剂，1份1％NaF混合即成

1.5% 对羟基联苯溶液：称取1.5g 对羟基联苯溶于100mL 热的0.5% NaOH 中（可保存半年）。

乳酸标准储备液(1mg/mL)：称取106.6mg 乳酸锂或171mg乳酸钙，以10% 的三氯乙酸定容至100mL（室温下可保存半年）

乳酸标准应用液（0.01mg/mL）：准确吸取1.0mL 乳酸标准储备液稀释定容至100mL，此液要求现用现配。

4.2.2.2 乳酸仪测定方法：破膜液、磷酸盐缓冲液、氯化钠。

 

4.3 实验方法

4.3.1 实验动物  同1.2.3.1

4.3.2 剂量设计和分组： 大鼠以人体每日每公斤体重推荐量的5倍为基本剂量，其余同1.1.3.2

4.3.3 实验步骤

4.3.3.1 高血乳酸模型的制作及血标本制备： 末次给样30min 后采血，然后不负重在温度为30℃的水中游泳10min后停止。乳酸仪测定方法：在游泳前各采血20μL加入40μL破膜液中，立即充分振荡破碎细胞；游泳后立即采血20μL加入40μL破膜液中振荡；休息20min 后再各采血20μL加入40μL破膜液中振荡，用乳酸仪测定。自配试剂测定方法同样在上述三个时间点各采血20μL按以下步骤操作。大鼠采尾血，小鼠用毛细管从内眦采血。

4.3.3.2 测定步骤

4.3.3.2.1自配试剂测定：于5mL 试管中加入0.48mL 1% NaF 溶液，准确吸取全血20μl 加入试管底部。用试管上清液清洗微量吸管数次，再加入1.5mL 蛋白沉淀剂，振荡混匀，于3000r/min 离心10min，取上清液，按下表操作。

 

 

上述步骤完成后，摇匀，置30℃水浴30min（每隔10min 振摇一次）。取出后放入沸水浴中加热90s，取出冷却至室温，在波长560nm 处用5mm 光径比色皿比色，空白管调零。

4.3.3.2.2 乳酸盐测定仪测定方法：按仪器操作说明书操作。

4.3.3.3  血乳酸含量计算

 

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　A_测定管

4.3.3.3.1自配试剂测定方法：  血乳酸含量（mg/100mL）= ──── ×100

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　A_标准管

4.3.3.3.2 乳酸盐测定仪测定方法：直接从乳酸仪上读数,实际值＝测得值×3（20μL样品加入40μL破膜液中，已稀释了3倍）。

 

4.4 数据处理及结果判定：

乳酸测定数据为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

实验结果判定：以三个时间点血乳酸曲线下面积为判定标准。任一试验组的面积小于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。

血乳酸曲线下面积计算方法：

血乳酸曲线下面积＝1/2×(游泳前血乳酸值＋游泳后0min的血乳酸值)×10＋1/2×(游泳后0min的血乳酸值＋游泳后休息20min的血乳酸值)×20

＝5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min的血乳酸值+2×游泳后休息20min的血乳酸值)。

 

5 结果判定