2.5.4.2.4.4.1 本实验为抗原抗体结合反应，操作时要注意防止可引起抗原、抗体失活的因素（如高温、冰冻等）。

2.5.4.2.4.4.2 测定时，要防止液体溅出，以免造成同位素污染，使本底值增高。

2.5.4.2.4.4.3 离心后，抽去上清液时勿将平铺在管底的免疫复合物吸起，否则测定结果不准确。

2.5.4.2.4.4.4 非特异管、零管是为鉴定试剂是否符合规定而设立的。

2.5.4.2.4.4.5 血清铁蛋白浓度也可用酶联免疫吸附法测定。具体测定方法按相应试剂盒说明书进行。

 

2.5.4.3 血清运铁蛋白饱和度测定

2.5.4.3.1原理

血清中加入过量的铁，使血清中的运铁蛋白全部与铁结合，达到饱和，过剩的铁用碳酸镁吸附除去，然后按测血清铁的方法，测定总结合的铁量，即为总铁结和力。从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。

2.5.4.3.2血清铁测定

    血清铁(S1)是指存在于血清中与血清运铁蛋白结合的铁，它以高铁的形式    附着在血清pl球蛋白的转递蛋白上，成人正常值为50—184µg／100mL。缺铁性贫血时常低于50µg／100mL，当血红蛋白浓度降低不明显时，血清铁已减少，被认为是早期缺铁性贫血诊断依据之一。

2.5.4.3.2.1 铬天青B铵盐比色法

    铬天青B铵盐作为显色剂测血清铁，较比过去多采用的联吡啶等作为显色剂有较高的灵敏度，其克分子吸光系数在630nm波长下为1.68×10⁵ L·mol^-1·cm^-1。可大大减少样品血清量，方法简便，准确。

2.5.4.3.2.1.1原理

    Fe³／Fe²与铬天青B(CAB)和十六烷基三甲基溴化铵(CTMA)反应，形成三元胶囊状络合物使试剂颜色加深，其颜色加深程度与血清铁含量成正比，在pH为4.6—5.5，波长为630nm时，有最大吸收峰，利用柠檬酸船为铁的掩蔽剂，样品为自身空白，不需除蛋白，即可测出血清铁的含量。

2.5.4.3.2.1.2试剂

2.5.4.3.2.1.2.1缓冲溶液  pH4.75，取25g无水醋酸钠，110g氯化钠，8mL冰醋酸，用蒸馏水定容1000mL。用酸度计测pH应为4.75。

2.5.4.3.2.1.2.2 显色剂

2.5.4.3.2.1.2.2.1   0.1％铬天青B铵盐溶液：取0.1g铬天青B铵盐，定容于l00mL蒸馏水中，放在棕色瓶中可在室温下保存1个月。

2.5.4.3.2.1.2.2.2  0.3％十六烷基三甲基溴化铵：取十六烷基三甲基溴化铵0.3g，用蒸馏水定容至100mL。

2.5.4.3.2.1.2.2.3  显色剂应用液：取90mL1.13.1.2.2.2液，60mL l.13.1.2.2.1液，小心混匀，用缓冲溶液定容至1000mL，放在棕色瓶内可保存1个月。

2.5.4.3.2.1.2.3 掩蔽剂：称17.0g柠檬酸(C₆H₈0₇·H20)，35.0g柠檬酸钠(Na₃C₆H₅0₇·H₂0)，约加50mL蒸馏水加热助溶，冷却后定容至l00mL。

2.5.4.3.2.1.2.4  铁标准液

2.5.4.3.2.1.2.4.1  贮备液：3mmol／L，取1.176g硫酸亚铁铵(6分子结晶水)至少量蒸馏水中，加50mL浓硝酸混匀反应10分钟，用蒸馏水定容至1000mL。

2.5.4.3.2.1.2.4.2  工作液：30µmol／L，取10mL贮备液，用蒸馏水定容至1000mL。

2.5.4.3.2.1.3 方法  

按下表加入各种试剂。   

混匀，放置20分钟，在721型分光光度计上，波长630nm，以空白管调零点记录光密度。

    注：①样品管和标准管以空白1调0点；

        ②空白管2以空白3调0点。

2.5.4.3.2.1.4   计算

                           样品管光密度—空白2管光密度

  血清铁浓度(µmol／L) =------------------------ ×  30

                                  标准管光密度

                              样品管光密度—空白2管光密度  

  或 血清铁浓度(µg／100mL) = ------------------× 167.55

                                      标准管光密度

2.5.4.3.2.1.5  注意事项

2.5.4.3.2.1.5.1  要求所用器皿用2N盐酸浸泡过夜，试剂纯度为分析纯以上，所用蒸馏水为双蒸水或去离子水。

2.5.4.3.2.1.5.2  缓冲液pH对结果影响较大，测定时pH应保证在4.70—4.80之间。

2.5.4.3.2.1.5.3  严格限制波长的选择(需经校下)，血清样品在607～609nm之间有一个杂质吸收峰。

 

2.5.4.3.2.2  原子吸收光谱法

    用原子吸收光谱法测定生物样品中微量元素的含量具有操作简便、快速、灵敏  度较高的优点，故被广泛应用。

2.5.4.3.2.2.1试剂

2.5.4.3.2.2.1.1混合酸消化液  山4份硝酸，1份高氯酸混合即成。

2.5.4.3.2.2.1.2铁标准溶液

2.5.4.3.2.2.1.2.1  铁标贮备液：取1.0000g纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1N盐酸稀释到1000mL，移入聚乙烯塑料瓶内，存放在4⁰C冰箱，1mL含1mg铁。

2.5.4.3.2.2.1.2.2铁标工作液：取10mL贮备液，用0.1N盐酸定容至l00mL，lmL=l00µg铁。

2.5.4.3.2.2.2 操作    。

2.5.4.3.2.2.2.1  样品收集及处理  取静脉血2mL于盛有l0mg草酸钾的5mL试管中(于每试管中加入0.2mL5％草酸钾，置烘箱中烤干即成)，离心(3000转／分)15分钟。将分离出的血浆吸入另一带盖小试管中，备用。

2.5.4.3.2.2.2.2  消化  取1.0mL血浆，于100mL高型烤杯中，约加3mL混合酸消化液，上盖表皿，放置数小时或过夜，在沙浴电热板上徐徐加热煮沸，在冒白色浓烟激烈作用后溶液呈无色或淡黄色。反应终了，取下烧杯(若酸用量不够，最后可出现溶液变黑现象，此时可再加2mL混合酸消化液继续消化直至五色)。冷却后用10～20mL去离子水冲洗表皿和杯壁，除去表皿继续加热，直到再度冒白色浓烟，待溶液体积接近蒸干，残留酸量不超过lmL，取下冷却，用蒸馏水稀释至3mL。

2.5.4.3.2.2.2.3  测定  

吸取0.0mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，5.0mL铁标准应用液，用0.1N盐酸定容至100mL，混合，各容量瓶中每mL分别相当于0µg，0.5µg，1µg，2µg，3µg，5µg铁。

    将处理后的样液，试剂空白，铁标系列溶液分别导入火焰进行测定，测定条件(Pekin-Elener403型原子吸收分光光度计)：波长248.3nm；空心阴极灯电流：30mA，狭缝宽0.2mm，空气流量13.51／min，乙炔流量：5.21／分。以铁含量对应浓度吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线求得样品铁含量。

2.5.4.3.2.2.2.4  计算

                  (A₁－A₂)×V

    X＝--------------------× 100

                       m

    式中：X─ 血浆中铁的含量(µg／100mi血清)。

          A₁─测定用样品液中铁的含量(µg／m1)。

          A₂─测定空白液中铁的含量(µg／m1)。

          V─样品处理液定容总体积(m1)。

m─ 血浆取样量(m1)