1.3.3.1.1.3 实验步骤

1.3.3.1.1.3.1 样品制备

全血样品：取血50μl加入0.5mL生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。血清样品：取血0.5mL室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。

1.3.3.1.1.3.2 标准曲线制作 

将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分别取0.1mL加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm，  激发波长536nm，发射波长550nm）

以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。

1.3.1.1.3.3样品测定

 

*全血 0.5mL(空白管加蒸馏水0.5mL，标准管加标准0.1mL、蒸馏水0.4mL)

＃1nmol/mL四乙氧基丙烷(标准)

 

血清0.1mL（或全血上清液0.5mL）→加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm，  激发波长536nm，发射波长550nm）

1.3.3.1.1.3.4 计算公式：

                                 B-A           B-A         1

过氧化脂质含量（nmol/mL血清） ＝── ×C×K ＝──× 1 ×──  

                                 F-A           F-A        0.1

 

                                 B-A         B-A        1    

过氧化脂质含量（nmol/mL血液）＝ ──×C×K＝──× 1×──

                                 F-A         F-A       0.05      

A:  空白管荧光度

B：样品荧光度

F：四乙氧基丙烷荧光度

C：四乙氧基丙烷浓度(1nmol/mL)

K：稀释倍数

1.3.3.1.1.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，实验结果阳性。

 

1.3.3.1.2比色法

1.3.3.1.2.1比色法原理

MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。

1.3.3.1.2.2 仪器与试剂

仪器  721分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。

试剂0.2M乙酸盐缓冲液 PH3.5

          0.2M乙酸溶液    185mL

          0.2M乙酸钠溶液  15mL

1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL

8.1%十二烷基硫酸钠SDS

0.8%硫代巴比妥酸TBA

0.2M磷酸盐缓冲液 PH7.4

0.2M磷酸氢二钠    1920mL

0.2M 磷酸二氢钾    480mL     

1.3.3.1.2.3 实验步骤

1.3.3.1.2.3.1 样品制备

全血样品：取血20μL加入0.98mL蒸馏水制成2％溶血液。

1.3.3.1.2.3.2样品测定

 

注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。