1.3.3.3 组织中脂褐质（Lipofasci）含量测定

1.3.3.3.1 原理

脂褐素是丙二醛与游离氨基的物质（如磷脂酰乙醇胺、蛋白质及核酸）交联而生成的具有荧光的化合物，即shill碱，可以用氯仿与甲醇的混合液作萃取剂，将其从组织中提取出来进行测定，测定shill碱的含量，可知道细胞被自由基损伤的程度，间接反映体内脂质过氧化水平。

1.3.3.3.2 仪器和试剂

仪器  荧光分光光度计、组织匀浆器、离心机、紫外灯、恒温水浴锅

试剂  氯仿（AR）

甲醇（AR）

氯仿－甲醇混合液（2：1 v/v）（新鲜配制）

0.1mol/L硫酸

硫酸奎宁标准液(0.1μg / mL 0.1mol/L 硫酸）

以上所用玻璃器皿均需经50％硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥。

1.3.3.3.3 实验步骤

取组织200mg，加入2:1(v/v)氯仿甲醇混合液4mL（w/v=1:20），用匀浆器在45℃水浴中2500r/min匀化1min，制成以氯仿甲醇混合液为介质的5％匀浆。随后加入4mL 蒸馏水，以2000r/min（匀浆器）充分混合1min，除去黄素干扰物，3000r/min离心10min后样品分为3层，上层为水相，中层为组织，下层为氯仿甲醇相。小心吸去水层，沿管壁穿过中层，将下层氯仿甲醇液取出，不可将水混入提取液中，若水混入提取液中，应再离心去除水。向氯仿甲醇提取液中加入甲醇0.2mL，轻轻振荡混匀，使之清澈透明，置紫外灯下照射30s，倒入石英杯中，测定荧光强度。

以硫酸奎宁（0.1μg/mL  0.1mol/L硫酸）为标准对照，在狭缝4.4，灵敏度3.6，激发波长360nm，发射波长450nm，其荧光强度为55－60U，在该条件下测定样品荧光强度。氯仿甲醇混合液为空白对照。

 

计算公式：

     

　　　       　　　　　样品荧光强度－空白荧光强度                 匀浆体积

脂褐质含量(μg/g组织)＝──────────────×硫酸奎宁浓度×────

　　　      　　　　　 硫酸奎宁荧光强度                 　　     样品重量

 

1.3.3.3.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，脂褐质含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，实验结果阳性。

1.3.3.3.5 注意事项：

1.3.3.3.5.1 吸取氯仿层时要非常小心,以免带入组织颗粒和水，影响荧光测定。

1.3.3.3.5.2.荧光化合物的全部化学性质与特点不清楚，有些正常生化物质，如视黄醛和黄素类化合物也具有类似荧光产物的荧光光谱，黄素类物质是水溶性物质，水洗氯仿甲醇混合液，便可除去；视黄醛是脂溶性的，在氯仿中经紫外线照射后迅速降解，其它一些共轭多烯化合物，用紫外线照射也可除去。

1.3.3.3.5.3.丙二醛与自由氨基的交联反应较为缓慢，Schiff碱的形成是一个长时间的过程，不能立即反映自由基损伤反应的变化。因此，给予受试样品的时间要长，一般2－3个月，长者可达6个月以上。

 

1.3.4 抗氧化功能酶活力测定

1.3.4 抗氧化功能酶活力测定

SOD催化超氧阴离子自由基（O₂^.－）生成H₂O₂，再由其它抗氧化功能酶如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除O₂^.－对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化,酶活性与生物年龄的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。

1.3.4.1 血/组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

1.3.4.1.1 原理

O₂^.－氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O₂^.－ 后形成的亚硝酸盐减少。

 

1.3.4.1.2仪器与试剂

仪器  721分光光度计、离心机、恒温水浴、匀浆器

试剂 65mM磷酸盐缓冲液(PBS) pH7.8

10mmol/L盐酸羟胺

  盐酸羟胺6.95mg，加PBS至10mL

7.5mmol/L黄嘌呤

  黄嘌呤11.41mg，加0.1M NaOH 2.5mL溶解，加PBS至10mL

0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶

  取10mg/mL黄嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS 9.8mL至10mL

0.1%甲萘胺

取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水，凉至室温加50mL冰醋酸，再加110mL凉蒸馏水至200mL

0.33%对氨基苯磺酸

取0.66g对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水，加50mL冰醋酸至200mL

SOD标准品

三氯甲烷

95％乙醇(v/v)

0.9%生理盐水