1.3.4.1.3 实验步骤

红细胞抽提液制备： 10μl全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95％乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。

组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行三次，制成1％组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红－詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min，取上清液20μl待测。

SOD标准抑制曲线  将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL（1.5μg/mL），用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。

                   对照管OD－测定管OD

SOD百分抑制率＝──────────────×100％

                     对照管OD

   

计算

每mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个单位。

              (对照管OD-测定管OD)  ×100％

                对照管OD               　  反应液总量(6mL)

SOD活力(U/mL)＝────────────×─────────×样品稀释倍数

                        50％                     取液量

 

也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/mL，乘以稀释倍数(1mL/取样量)。

    若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/g Hb。

 

样品测定步骤：

 * A 所用样品的量

注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

1.3.4.1.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

受试样品组与模型（或老龄／正常）对照组比较，SOD活力升高有统计学意义，判定该受试样品有升高SOD作用，实验结果阳性。若受试样品组SOD升高接近空白（或少龄）对照组，两者统计差异无显著性，则说明该受试样品具有较强的升高SOD作用。

 

1.3.4.2 血/或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定

1.3.4.2.1 原理

    谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。

1.3.4.2.2 试剂和仪器

仪器  721分光光度计、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器

试剂  叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0

加蒸馏水至100mL，用少量HCL、N_aOH调pH7.0，4℃保存。

1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液

GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。

1.25-1.5mmol/LH₂O₂溶液

取30％H₂O₂ 0.15-0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。

偏磷酸沉淀液

加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。

0.32mol/LN_a2HPO₄溶液:

N_a2HPO₄  22.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。

DTNB显色液

加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。

           0.2M磷酸缓冲液PH7.4

           0.9%生理盐水