1.3.4.2.3 实验步骤

1.3.4.2.3.1 样品制备

　　血样稀释液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻，

　　组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％(v/v)甘油分装于塑料管，放置-20～-80℃，可保存数周，而酶活力不减。

1.3.4.2.3.2 GSH标准曲线的制作：

　　取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH标准液。

　　取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L N_a2HPO₄ 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。

　　以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD₄₂₃值为纵坐标，绘制标准曲线。

 

1.3.4.2.3.3 测定步骤：

 

显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。

* 样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。

**血样稀释液     0.1-0.4mL

  组织上清液     1:20稀释，取稀释液0.4mL

1.3.4.2.3.4 计算

　　鼠全血GSH-Px活力单位  规定每1mL全血，每分钟，扣除非酶反应的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1为一个酶活力单位。

                                   非酶管log[GSH]-样品管log[GSH]

鼠全血GSH-Px活力单位(U/mL全血)= ─────────────────

                                         3min×0.004mL

                         log[非酶管OD－空白管OD]-log[样品管OD-空白管OD]

                       = ────────────────────────

                                        3min×0.004mL

 

　　组织GSH-Px比活力单位  规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。

                                        (非酶管OD－样品管OD]×A^**×5

组织GSH-Px比活力单位(U/mg蛋白) = ───────────────────

                                          3min×样品蛋白质的mg数 ^*

    *  Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量

 

           标准GSH浓度(μmol/L)

    ** A=───────────  即标准曲线斜率。

          标准GSH光密度(OD)

 

1.3.4.2.4 数据处理及结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

受试样品组与模型（或老龄／正常）对照组比较，GSH-Px活力升高有统计学意义，判定该受试样品有升高GSH-Px作用，实验结果阳性。

 

1.3.4.2.5 注意事项

1.3.4.2.5.1 由于H₂O₂易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。

                 OD

浓度(mmol/L)＝─────────

                0.036(消光系数)

若OD值为0.45，则表明H₂O₂浓度为12.5mmol/L。

 

1.3.4.2.5.2  5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min内读数准确。