2 试剂和仪器

仪器  721分光光度计、恒温水浴锅、微量加样器、离心机

试剂  叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0

加蒸馏水至100mL，用少量HCL、N_aOH调pH7.0，4℃保存。

1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液

GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。

1.25-1.5mmol/L  H₂O₂溶液

取30％H₂O₂ 0.15-0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。

偏磷酸沉淀液

加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。

0.32mol/L N_a2HPO₄溶液:

N_a2HPO₄  22.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。

DTNB显色液

加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。

 

3 实验步骤

3.1 样品制备

　　血样稀释液  取血20μl加入到1mL 双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻，

3.2  GSH标准曲线的制作：

　　取1.0mmol/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH标准液。

　　取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L N_a2HPO₄ 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。

　　以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD₄₂₃值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.3 测定步骤：

试剂	样品管(mL)	非酶管(mL)
1.0mmol/L GSH	0.4	0.4
血样稀释液	0.4
双蒸水 *		0.4
37℃水浴预温5min
H2O2(37℃预热)	0.2	0.2
37℃水浴准确反应5min(严格控制时间)
偏磷酸沉淀液	4	4
3000r/min离心10min
离心上清液	2	2
双蒸水
偏磷酸沉淀液
0.32mol/L  Na2HPO4	2.5	2.5
DTNB显色液	0.5	0.5

显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。

 

3.4 计算

　　全血GSH-Px活力单位  规定每8μl全血，在37℃反应5min，扣除非酶反应后，使GSH浓度降低1μmol/L浓度为一个酶活力单位。

　　全血GSH-Px活力U/mL血=（非酶管OD-样品管OD）×A^*×5^**

      　标准GSH浓度（μmol/L）

* A＝──────────── 即标准曲线的斜率

      标准GSH光密度（OD）

** 5 换算成1mL反应液中GSH浓度时，需乘以稀释倍数5

 

3.5 注意事项

3.5.1 由于H₂O₂易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。

                    OD

浓度(mmol/L)＝─────────

                 0.036(消光系数)

若OD值为0.45，则表明H₂O₂浓度为12.5mmol/L。

 

3.5.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min内读数准确。