1 动物实验

1.1跳台实验

1.1.1 原理

　　反应箱底铺有通36v电的铜栅，动物受到电击，其正常反应是跳上箱内绝缘的平台以避免伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台，如此训练5min，并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数，以此作为学习成绩。24h 或48h 重作测验，此即记忆保持测验。记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min 内的错误总数。停止训练5天后（也可以在训练后的一周、两周或其它时间点）进行记忆消退实验。

1.1.2 仪器与试剂

跳台仪：该装置为10×10×60cm³  的被动回避条件反射箱，用黑色塑料板分隔成5间。底面铺以铜栅，间距为0.5cm，可以通电，电压强度由一变压器控制。每间左后角置一高和直径均为4.5cm的绝缘平台。

试剂：樟柳碱、环已酰亚胺、乙醇。

1.1.3 实验方法

1.1.3.1 实验动物  推荐使用近交系小鼠。断乳鼠或成年鼠（18－22g）。用于改善老年人记忆的产品必须采用成年鼠。雌雄均可，单一性别，每组10－15只。

1.1.3.2 剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.1.3.3 实验方法及步骤

1.1.3.3.1 受试样品对正常小鼠记忆的影响

　　末次给样后次日（或一次给样后1h）开始训练。将动物放入反应箱内（台上、台下）适应环境3min，然后将动物放置反应箱内的铜栅上，立即通以36v 的交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台（绝缘体），以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台上。训练一次后，将动物放在反应箱内的平台上，记录5min 内各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期，以此作为学习成绩（记忆获得）。24或48h 后进行重测验，将小鼠放在平台上，记录各鼠第一次跳下平台的潜伏期、各鼠3min 内电击次数和受电击的动物数总数，同时计算出现错误反应的动物的百分率（受电击的动物数占该组动物总数的百分率）（记忆巩固）。停止训练5天后（包括第5天）可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验（记忆再现，方法同重测验）。

1.1.3.3.2 受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响

1.1.3.3.2 1 模型制造

记忆获得障碍模型制造：训练前10min 腹腔注射樟柳碱或东莨菪碱5mg/kg体重；

记忆巩固障碍模型制造：训练前10min 腹腔注射环已酰亚胺120mg/kg体重；

记忆再现障碍模型制造：重测验前30min 灌胃30％ 的乙醇0.1mL/10g体重。

1.1.3.3.2.2 记忆测试的操作方法：同1.1.3.3.1。

1.1.4 数据处理及结果判定

潜伏期结果为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

错误次数和3min内跳下平台的动物数均为记数资料，可用X²检验， 四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。

若受试样品组与对照组比较，潜伏期明显延长，错误次数或跳下平台的动物数明显少于对照组，差异有显著性，以上三项指标中，任一阶段（记忆获得、记忆巩固和记忆再现）的任一项指标阳性，均可判定该项实验阳性。

1.1.5 注意事项

1.1.5.1 动物在24h 内有其活动周期，不同时相处于不同的觉醒水平，故每次实验应选择同一时相（上午8－12点或下午1－4点），前后2天的实验要在同一时间内完成。

1.1.5.2 实验应在隔音,光强度和温、湿度适宜且保持一致的行为实验室进行。

1.1.5.3 推荐使用纯系动物，实验前数天将动物移至实验室以适应周围环境。

1.1.5.4 实验者必须每天与动物接触，如：喂水、喂食和抚摸动物。

1.1.5.5 减少非特异性干扰，如：情绪、注意、动机、觉醒、运动活动水平、应激和内分泌等因素。

1.1.5.6 考虑动物种属差异。

 

1.2．避暗法

1.2.1 原理

　　利用小鼠嗜暗的习性设计一个装置，一半是暗室，一半是明室，中间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅，并与一计时器相连，计时器可自动记录潜伏期的时间。小鼠进入暗室即受到电击，计时自动停止。

1.2.2 仪器和试剂

避暗仪：该装置分明暗两室。明室大小为12cm×4.5cm，其上方约20cm 处悬一40w 钨灯丝。暗室较大，大小为17cm×4.5cm，两室之间有一直径约3cm 的圆洞。两室底部均铺以铜栅。暗室底部中间位置的铜栅可以通电，电击强度可在一旋钮上任意选择。一般采用40v 电压。暗室与一计时器相连，计时器可自动记录潜伏期的时间。

试剂：樟柳碱、环己酰亚胺、乙醇。

1.2.3 实验方法

1.2.3.1 实验动物  同1.1.3.1

1.2.3.2 剂量设计和分组  同1.1.3.2

1.2.3.3 实验方法及步骤

1.2.3.3.1 受试样品对正常小鼠记忆的影响

　　末次给样后次日（或一次给样后1h）开始训练。实验时将小鼠面部背向洞口放入明室，同时启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时器自动停止，取出小鼠，记录每鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需的时间，此即潜伏期，训练5min，并记录5min内电击次数（记忆获得）。24h 或48h后重作测验，记录每只动物进入暗室的潜伏期和5min 内的电击次数，并计算5min 内进入暗室（错误反应）的动物百分率（记忆巩固）。停止训练5天后可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验（记忆再现）。

1.2.3.3.2 受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响:

1.2.3.3.2.1 模型制造：方法同1.1.3.3.2.1

1.2.3.3.2.2 操作方法：同1.2.3.3.1

1.2.4 数据处理及结果判定

潜伏期时间为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

5min 内进入暗室的次数和5min内进入暗室的动物数均为计数资料，可用X²检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。

若受试样品组小鼠进入暗室的潜伏期明显长于对照组，5min内进入暗室的错误次数或5min 内进入暗室的动物数少于对照组，且差异有显著性，以上三项指标中任一阶段（记忆获得、记忆巩固和记忆再现）的任一项指标阳性，均可判定该项实验阳性。

1.2.5 注意事项：同1.1.5