3.2 迟发型变态反应（DTH）

    可任选下列方法之一

3.2.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH（耳肿胀法）

3.2.1.1 原理

    二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将其稀释液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7天 后再将其涂抹于耳部，使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24～48h达高峰，故于此时测定其肿胀程度。

3.2.1.2 材料

    DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。

3.2.1.3 实验步骤

3.2.1.3.1 试剂配制  DNFB溶液  DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250μL注射器通过瓶盖取用。

3.2.1.3.2 致敏  每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约 3cm×3cm、用 DNFB 溶液50μL均匀涂抹致敏。

3.2.1.3.3 DTH的产生与测定  5天 后，用 DNFB 溶液 10μL 均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后 24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。

3.2.1.4 数据处理与结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于与对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。

3.2.1.5 注意事项

    操作时应避免DNFB与皮肤接触。

3.2.2 绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH（足跖增厚法）

3.2.2.1 原理

    SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBC攻击时，即可见攻击部位出现迟发型变态反应。

3.2.2.2 材料

    游标卡尺（精密度0.02mm）、SRBC、微量注射器（50μL）。

3.2.2.3 实验步骤

3.2.2.3.1  致敏  小鼠用2％(v/v)SRBC腹腔或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL（约1×10⁸个SRBC）。

3.2.2.3.2  DTH的产生与测定  免疫后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只鼠20μL（约1×10⁸个SRBC），注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。

3.2.2.4 数据处理和结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH 的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。

3.2.2.5 注意事项

    测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。

    攻击时所用的SRBC要新鲜（保存期不超过1周）。