3.3 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）

3.3.1 原理

    用绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数大体可反映抗体分泌细胞数。

3.3.2 仪器和材料

    二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC、补体（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。

3.3.3 实验步骤

3.3.3.1  SRBC  绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

3.3.3.2 制备补体  采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中， 4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA液按1∶8－15稀释。

3.3.3.3 玻片涂膜  在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0.5g琼脂糖加双蒸水至100mL，加热溶解），待干后放片盒可长期保存备用。

3.3.3.4 免疫动物  取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC  5×10⁷～2×10⁸个。也可将压积SRBC 用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL。

3.3.3.5 脾细胞悬液制备

    将SRBC免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank's液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，离心（1000/min）10min，用Hank's液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5x10⁶个/mL。也可将细胞悬浮在8mLHank's液，测定脾空斑形成数。

3.3.3.6 空斑的测定

    将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100mL）加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10% SRBC(v/v，用SA液配制)，20μL脾细胞悬液（5×10⁶个/mL）或25μL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1～1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体（1：8）加入到玻片架凹槽内，继续温育1～1.5h后，计数溶血空斑数。

3.3.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

用空斑数/10⁶脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。

 

3.4 血清溶血素的测定

    可任选下列方法之一。

3.4.1 血凝法

3.4.1.1 原理

    用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。

3.4.1.2 仪器和材料

    SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机

3.4.1.3 实验步骤

3.4.1.3.1  SRBC  绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离  取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。

3.4.1.3.3 凝集反应  用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL ，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。

3.4.1.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

血清凝集程度一般分为5级（0－Ⅳ）记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。

抗体水平＝（S₁+2S₂+3S₃……nS_n）

式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

0级  红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。

Ⅰ级  红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。

Ⅱ级  凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。

Ⅲ级  凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。

Ⅳ级  凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

3.4.1.5 注意事项

    血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。