3.4.2 半数溶血值（HC₅₀）的测定

3.4.2.1 原理

    用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。

3.4.2.2 仪器和材料

    721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、都式试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）

3.4.2.3 实验步骤

3.4.2.3.1  SRBC  绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

3.4.2.3.2 制备补体  采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA液按1∶8稀释。

3.4.2.3.3 免疫动物及血清分离  取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％（v/v）的细胞悬液，，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，使血清充分析出，2000r/min离心10min，或6000r/min,4min,收集血清。

3.4.2.3.4 溶血反应  取血清用SA缓冲液稀释（一般为200～500倍）。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(v/v)SRBC  0.5mL，补体1mL（用SA液按1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA液代替）。置37℃恒温水浴中保温15～30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，加都氏试剂3mL，同时取10％(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。

3.4.2.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

溶血素的量以半数溶血值（HC₅₀）表示，按下列公式计算，受试样品组的HC₅₀显著高于对照组的HC₅₀，可判定该项实验结果阳性。

                      样品光密度值

样品HC₅₀＝─────────────────×稀释倍数

               SRBC半数溶血时的光密度值

 

3.5 小鼠碳廓清实验

3.5.1  原理

    在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系，即吞噬速度与血碳浓度成正比，而与已吞噬的碳粒量成反比。

    以血碳浓度对数值为纵座标，时间为横座标，两者呈直线关系。此直线斜率(K)可表示吞噬速率，亦可称为未经校正的吞噬指数。因动物肝、脾重量不等，故K值亦不同。为此，一般以校正的吞噬指数a表示。a反映了每单位组织重量的吞噬活性，公式如下：

3.5.2 仪器和试剂

    721分光光度计、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na₂CO₃

3.5.3 实验步骤

3.5.3.1 溶液配制

    注射用墨汁  将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。

    Na₂CO₃溶液  取0.1gNa₂CO₃，加蒸馏水至100mL。

3.5.3.2 注射墨汁  称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重0.1mL计算。待墨汁注入，立即计时。

3.5.3.3 测定

    注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到 2mL 0.1%Na₂CO₃溶液中。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD），以Na₂CO₃溶液作空白对照。

    将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。

3.5.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。

      lgOD₁-lgOD₂

K＝───────

        t₂－t₁

 

 

3.5.5 注意事项

    静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。

    墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀。

    使用新的墨汁时，应在实验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在20～30min内不易廓清，而激活的小鼠可明显廓清。