1. 实验动物

    推荐用近交系小鼠，如C₅₇BL/6J、BALB/C等，6－8周龄，18－22g，雌雄均可，数量为单一性别，每组10－15只。

2. 剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二各剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，免疫模型动物实验可适当延长。

3. 实验方法

3.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

    可任选下列方法之一

3.1.1 MTT法

3.1.1.1 原理

    当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。

3.1.1.2 仪器和材料

    RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）

    200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台

3.1.1.3 实验步骤

3.1.1.3.1 试剂配制

完全培养液  RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100ug/L）及5×10^－5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。

ConA液  用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃）保存。

无菌Hank's液  用前以3.5％的无菌NaHCO₃调pH7.2-7.4。

MTT液  将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。

酸性异丙醇溶液  96mL 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。

3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。

3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应

将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA 液（相当于7.5ug/mL），另一孔作为对照，置5％CO₂，37℃CO₂孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50μL /孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3～6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，721分光光度计上在波长570nm测定OD值。

3.1.1.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。

3.1.1.5 注意事项

选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会产生抑制作用，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度。

 

3.1.2 同位素掺入法

3.1.2.1 原理

淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA 等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入³H－胸腺嘧啶核苷（³H-TdR），则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。

3.1.2.2 仪器和材料

    RPMI-1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）、³H-TdR、闪烁液[2,5-二苯基恶唑（PPO）0.5g、1,4-双-(5-苯基 恶唑基)-苯（POPOP）0.25g、二甲苯500mL混匀]

    200目筛网，96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。

3.1.2.3 实验步骤

3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗3次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×10⁶个/mL。

3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应:

    将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA 作为对照。置5％ CO₂，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入³H-TdR 20μL，使其终浓度为(3.7-18.5)×10⁴Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。

3.1.2.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示

      实验孔cpm

SI=─────────

      对照孔cpm

    受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。