3.7.2 同位素³H-TdR测定法

1.3.7.2.1 原理

    将用同位素³H-TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞³H-TdR的释放率即可反应NK细胞的活性。

3.7.2.2 仪器和材料

    液体闪烁仪、多头细胞取集器、二氧化碳培养箱、³H-TdR、RPMI1640 完全培养液、Hank's液(pH7.2～7.4)、YAC-1细胞、Triton X-100

3.7.2.3. 实验步骤

3.7.2.3.1 靶细胞的标记

    取传代后24h生长良好的YAC-1细胞（存活率>95％）按1×10⁶/mL YAC-1细胞悬液加³H-TdR 10uCi进行标记，于37℃、5％CO₂培养箱中培养2h，每30min振荡1次。标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为1×10⁵个/mL。

3.7.2.3.2  脾细胞悬液的制备（效应细胞）

    无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。

3.7.2.3.3  NK细胞活性测定

    在96孔培养板中每孔加100μL标记的靶细胞，实验孔加100μL效应细胞，空白对照孔加100μL培养液，最大释放孔加100μL  2.5% Triton X-100。每个样品设3个复孔，置5%CO₂、37℃培养箱内温育4h，用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪进行测量。

按下式计算NK细胞活性：

 

                              实验孔cpm

NK细胞活性（%）=(1－ ──────────────────) ×100%

                    空白对照孔cpm － 最大释放孔cpm

3.7.2.4 数据处理及结果判定

NK细胞活性需进行数据转换，X＝Sin^-1 ，式中P为NK细胞活性，用小数表示。在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性

 

4. 增强免疫力功能结果判定

增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品增强免疫力功能。

细胞免疫功能结果判定：细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。

体液免疫功能结果判定：体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。

单核—巨噬细胞功能结果判定：单核—巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核—巨噬细胞功能结果阳性。