3.6.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）

3.6.2.1 原理 

    巨噬细胞能吞噬鸡红细胞。将上述2种细胞温育后染色，在油镜下计算吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的百分比，并观察细胞内鸡红细胞的形态。据此判断巨噬细胞的吞噬功能和消化功能。

3.6.2.2 仪器和材料

    显微镜、鸡红细胞、丙酮、甲醇、生理盐水、Giemsa染液。

3.6.2.3 实验步骤

3.6.2.3.1 鸡红细胞悬液制备  取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤2～3次，离心（2000r/min，10min），去上清，用生理盐水配成20％(v/v)的鸡红细胞悬液。

3.6.2.3.2 吞噬功能测定  每鼠腹腔注射20% 鸡红细胞悬液1mL。间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置37℃ 孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1:1 丙酮甲醇溶液固定，4% （v/v） Giemsa- 磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。

3.6.2.4 数据处理及结果判定                    

油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。

                  吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数

吞噬百分率（%） = ─────────────── ×100

                计数的巨噬细胞数

 

             被吞噬的鸡红细胞总数

吞噬指数= ─────────────

               计数的巨噬细胞数

 

在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度。借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能，通常分为4级：

 Ⅰ级：  未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核浅紫色。

 Ⅱ级：  轻度消化。胞质浅黄绿色、胞核固缩呈紫蓝色。

 Ⅲ级：重度消化。胞质淡染，胞核淡浅灰色。

  Ⅳ级： 完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。

以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行数据转换，X＝Sin^-1 ，式中P为吞噬百分率或吞噬指数，用小数表示，然后再进行方差分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

受试样品组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百分率、吞噬指数比较，差异均有显著性，方可判定该项实验结果阳性。

 

3.7 NK细胞活性测定

    可任选下列方法之一

3.7.1 乳酸脱氢酶（LDH）测定法

3.7.1.1 原理

    活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H^＋被还原成紫红色甲月赞 类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。

3.7.1.2 仪器和材料

    酶标仪、YAC-1细胞、Hank's液（pH7.2～7.4）、RPMI1640完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2）、1％NP40或2.5%Triton

3.7.1.3 实验步骤

3.7.1.3.1 LDH基质液的配制

    乳酸锂 5×10^-2mol/L

    硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10^-4mol/L

    吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS） 2.8×10^-4mol/L

    氧化型辅酶Ⅰ（NAD） 1.3×10^-3mol/L

    将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH8.2）

3.7.1.3.2 靶细胞的传代（YAC-1细胞）

    实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。

3.7.1.3.3 脾细胞悬液的制备（效应细胞）

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液，1000rpm，10min离心，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95%以上)，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。

3.7.1.3.4  NK细胞活性检测

 取靶细胞和效应细胞各100μL（效靶比50:1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5%Triton各100μL；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。

按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。

                      反应孔OD－自然释放孔OD

NK细胞活性（%）＝ ────────────────── × 100%

                   最大释放孔OD－自然释放孔OD

3.7.1.4 数据处理及结果判定

NK细胞活性需进行数据转换，X＝Sin^-1 ，式中P为NK细胞活性，用小数表示，然后再进行方差分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F_0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F_0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.7.1.5 注意事项

    靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95％

    比色时环境温度应保持恒定

    LDH基质液应临用前配制

    在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过100。