1 动物实验

1.1实验动物

推荐用近交系小鼠，18-22g，单一性别，每组10－15只。

1.2剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间14天，必要时可以延长至30天。

1.3 实验步骤

在给予受试样品之前，无菌采取小鼠粪便0.1g，10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上。培养后，以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算出每克湿便中的菌数，取对数后进行统计处理。最后一次给予受试样品之后24h，与实验前同样方式取直肠粪便，检测肠道菌群，方法同上。

1.4 观察指标

体重、双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌。

1.5 数据处理和结果判定：

资料可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< 0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

比较实验前后自身及组间双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌的变化情况，实验组实验前后自身比较差异有显著性，或实验后实验组与对照组组间比较差异有显著性、且实验组实验前后自身比较差异有显著性，符合以下任一项，可以判定该受试样品动物实验结果阳性。

1.5.1 粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，肠杆菌、肠球菌无明显变化。

1.5.2 粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，肠杆菌和/或肠球菌明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌/乳杆菌增加的幅度。

 

2 人体试食试验

2.1 受试者纳入标准

2.1.1 一个月内未患过胃肠疾病者。

2.1.2 一个月内未服用过抗生素者。

2.2 受试者排除标准

2.2.1 年龄在65岁以上者，妊娠或哺乳期妇女，过敏体质及对本保健品过敏者。

2.2.2 合并有心血管、脑血管、肝、肾和造血系统等严重疾病及内分泌疾病，精神病患者。

2.2.3 停服受试样品或中途加服其它药物,无法判断功效或资料不全者。

2.2.4 短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。

2.3 试验设计及分组要求

采用自身和组间两种对照设计。按受试者的菌群状况随机分为试食和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、饮食因素等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。

2.4.受试样品的剂量和使用方法

试食组按推荐服用方法、服用量服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用阴性对照。受试样品给予时间14天，必要时可以延长至30。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。

2.5观察指标

2.5.1 安全性指标：

2.5.1.1 一般状况  包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等

2.5.1.2 血、尿、便常规检查

2.5.1.3 肝、肾功能检查（仅在试验开始前检查一次）

2.5.1.4 胸透、心电图、腹部B超检查（仅在试验开始前检查一次）

2.5.2 功效性指标：双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、拟杆菌、产气荚膜梭菌。

2.6 试验步骤：在给予受试样品之前，无菌采取受试者粪便1.0g，10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上。培养后，以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算出每克湿便中的菌数，取对数后进行统计处理。最后一次给予受试样品之后24h，再次检测，方法同上。

2.7数据处理和结果判定

试验数据为计量资料，可用t检验进行分析。凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验；但变异系数太大（如CV>50％）的资料应用秩和检验。

符合以下任一项，且试验组试食前后自身比较及试食后试食组与对照组比较，差异均有显著性，可以判定该受试样品具有调节肠道菌群功能的作用。

2.7.1 粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，肠杆菌、肠球菌、拟杆菌无明显变化。

2.7.2 粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，肠杆菌和/或肠球菌、拟杆菌明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌/乳杆菌增加的幅度。