动物实验

1 负重游泳实验

1.1 检验原理

运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度。

1.2 仪器与器材

游泳箱（大小约50cm×50cm×40cm），电子天平、铅皮。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物  推荐使用纯系小鼠，成年小鼠，体重18－22g，。

1.3.2 剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.3.3 实验步骤

末次给予受试样品30min后（酒类样品测试当天可以不灌胃），置小鼠在游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温25℃±1.0℃，鼠尾根部负荷5％体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间。

1.4 数据处理及结果判定

游泳时间为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

若受试样品组游泳时间明显长于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。

1.5 注意事项

1.5.1 每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多，否则互相挤靠，影响实验结果。

1.5.2 水温对小鼠的游泳时间有明显的影响，因此要求各组水温控制一致，每一批小鼠下水之前都应测量水温，水温以25℃为宜，如果过低可能引起小鼠痉挛，影响实验结果，过高（30℃）则游泳时间太长不便于操作。

1.5.3 铅皮缠绕松紧应适宜。

1.5.4 观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动。如果小鼠漂浮在水面四肢不动，可用木棒在其附近搅动。

1.5.5 不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异。因此受试样品组和对照组应采用同一批动物同时进行实验。

 

2 血清尿素测定

全自动生化仪测定和二乙酰—肟法任选一种。

2.1 全自动生化仪测定：按有关仪器说明书和试剂盒操作。

2.2 二乙酰—肟法

2.2.1原理

样品中尿素在氯化高铁—磷酸溶液中与二乙酰—肟和硫氨脲共煮，形成一种红色的化合物Diazine，其颜色的深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准管比较，可求出尿素的含量。

2.2.2 仪器和试剂

2.2.2.1 721分光光度计，10mL 带塞试管，1mL（或1.5mL）塑料离心管，电炉，锅，灌胃针头。

2.2.2.2 尿素试剂盒（二乙酰－肟法）：二乙酰-肟应用液、氯化铁－磷酸应用液、尿素标准液（20.0 mg/dL）。

2.2.2.3 若无试剂盒，可自行配制试剂。试剂配制方法如下：

1g/L 二乙酰—肟溶液：取二乙酰—肟1.0g，氨基硫脲（thiosemicarbazide）0.2g，氯化钠4.5g，溶于蒸馏水并加至1000mL。

33g/L 三氯化铁溶液：取三氯化铁1.0g溶于浓磷酸20mL 中，加蒸馏水10mL，摇匀。

酸溶液：取蒸馏水800mL，慢慢加入浓硫酸50mL，边加边摇；再加入85％磷酸50mL，摇匀。加入33g/L 三氯化铁溶液1.5mL，加水至1L。

10 m mol/L 尿素标准液（尿素28.01mg/dL）：精确称取尿素（AR）150.3mg 溶于16 m mol/L 苯甲酸溶液并加至250mL。

16 m mol/L 苯甲酸液：取苯甲酸2.0g 溶于蒸馏水1000mL 中，加浓硫酸0.8mL。