4.3.3.4样品测定步骤：

混匀，25℃恒温水浴20min

混匀15min后，倒入1cm光径比色杯，以蒸馏水调零，530nm处比色测定OD值。

 * A 所用样品的量

   

4.4 数据处理及结果判定

SOD活性值为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

辐射模型对照组与阴性对照组SOD活性进行两样本均数的成组双侧t或t’检验，差异具有显著性，则判定辐射损伤模型成立。

任一剂量组与辐射模型对照组比较，血／组织中SOD活性增强，差异有显著性，则可判定该实验阳性。

 

5．血清溶血素实验

5.1原理

免疫系统是机体辐射损伤较敏感的组织之一，血清溶血素值可代表体液免疫系统的状况。在一定范围内，照射剂量与血清中溶血素水平成反比，恢复时间与血清中溶血素水平成正比，血清中溶血素可代表机体体液免疫系统受损的状况。具有辐射危害辅助保护作用的受试物对受辐射损伤机体的免疫系统具有防护作用。

5.2实验方法

5.2.1 实验动物：小鼠，18－22g，单一性别，每组10－15只。

5.2.2剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。

5.2.3 实验步骤

受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择1Gy-3Gy。于照射后20天内，进行血清溶血素的测定。（可任选下列方法之一）

5.2.3.1 血凝法

5.2.3.1.1 原理

    用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。

5.2.3.1.2 仪器和材料

    SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机

5.2.3.1.3 实验步骤

5.2.3.1.3.1  SRBC  绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

5.2.3.1.3.2 免疫动物及血清分离  取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。

5.2.3.1.3.3 凝集反应  用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL ，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。

血清凝集程度一般分为5级（0－Ⅳ）记录，按下式计算抗体积数，

抗体水平＝（S1+2S2+3S3……nSn）

式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

0级  红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。

Ⅰ级  红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。

Ⅱ级  凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。

Ⅲ级  凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。

Ⅳ级  凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

5.2.3.1.4 数据处理及结果判定

抗体积数为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

受试样品组的抗体积数显著高于模型对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。

5.2.3.1.5 注意事项

    血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。

5.2.3.2 半数溶血值（HC50）的测定

5.2.3.2.1 原理

    用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。

5.2.3.2.2 仪器和材料

    721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、都式试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）

5.2.3.2.3 实验步骤

5.2.3.2.3.1  SRBC  绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

5.2.3.2.3.2 制备补体  采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA液按1∶8稀释。

5.2.3.2.3.3 免疫动物及血清分离  取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％（v/v）的细胞悬液，，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，使血清充分析出，2000r/min离心10min，或6000r/min,4min,收集血清。

5.2.3.2.2.3.3 溶血反应  取血清用SA缓冲液稀释（一般为200～500倍）。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(v/v)SRBC  0.5mL，补体1mL（用SA液按1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA液代替）。置37℃恒温水浴中保温15～30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，加都氏试剂3mL，同时取10％(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。

溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下列公式计算，

         　　样品光密度值

样品HC50＝─────────────────×稀释倍数

               SRBC半数溶血时的光密度值

5.2.3.2.4 数据处理及结果判定

血清溶血素含量为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

辐射模型对照组与阴性对照组血清溶血素含量进行两样本均数的成组双侧t或t’检验，差异具有显著性，则判定辐射损伤模型成立。

任一剂量组与辐射模型对照组比较，血清溶血素半数溶血值增多，差异有显著性，则可判定该实验阳性。

 

结果判定

在外周血中白细胞计数实验、骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数实验、小鼠骨髓细胞微核实验、血／组织中超氧化物歧化酶活性实验、血清溶血素含量实验中，任何两项实验结果阳性，可判定该受试样品具有对辐射危害有辅助保护功能的作用。