以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中反应2h。结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗细胞，加入含10%小牛血清的培养液，放回培养箱，于24h内收获细胞。于收获前4h，加入秋水仙素（终浓度为1μg/ml）。如果用于检测SCE频率，则待受试物与细胞反应结束后，加入含20μmol/L5-溴脱氧脲苷（BrdU）的培养液，于黑暗的环境下培养27h，加入秋水仙素后4h收获细胞。 5.14.3.4收获细胞时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10%小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000~1200r/min的速度离心5~7min，弃去上清液，加入0.075mol/LKC1溶液低渗处理，继而以甲醇和冰醋酸液（容积比3：1）进行固定。按常规制片，作染色体分析用的标本可直接用姬姆萨液染色，检测SCE频率的标本需进行分化染色，将制备好的玻片通过pH6.8的磷酸盐缓冲液1min，移入Hoechst33258液（终浓度为1μg/ml）中12min，再通过磷酸盐缓冲液1min。移至特制的黑盒中，经紫外线照射（30W，距离12cm）15min，将玻片移至2×SSC液中，在62℃水浴内1.5h，最后经姬姆萨染色。 作染色体分析时，对每一处理组选100个分散良好的中期分裂相进行染色体畸变分析。作SCE频率计数时，选择25个细胞计数SCE频率。 5.14.4结果评价：对染色体畸变率用X2检验，对SCE检测用T检验进行统计学处理，以评价受试物的致突变性。 5.15哺乳动物骨髓细胞染色体畸变率检测试验 5.15.1意义：在动物以不同途径接触受试化学物后，用细胞遗传学的方法检测骨髓细胞染色体畸变率的增加，从而评价受试物的致突变性，进而预测致癌的可能性。 5.15.2动物选择：选用成年小鼠或大鼠。 5.15.3剂量选择：选用1/2、1/5、1/10、和1/20LD50剂量为试验组，另设阳性对照和阴性对照各一组，阳性对照组可用苯，剂量为0。15ml/只，阴性对照为溶剂对照。每组5只动物。 5.15.4染毒方式：可用经口灌入的方式，共染毒两次，间隔24h，于第二次给药后6h处死动物，于处死前4h腹腔注射秋水仙素（按剂量4mg/kg）。 5.15.5实验步骤 5.15.5.1用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨，剃除肌肉等组织。 5.15.5.2剪去股骨两端，用注射器吸取5ml生理盐水，从股骨一端注入，用10ml离心管，从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。 5.15.5.3将细胞悬液以1000r/min的速度离心5~7min，去除上清液。 5.15.5.4加入0.075mol/LKC1溶液7ml，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37℃水浴中低渗处理7min，加入2ml固定液（冰醋酸：甲醇=1：3），混匀，以1000r/min的速度离心7min，弃去上清液。 5.15.5.5.加入7ml固定液，混匀，固定7ml，以1000r/min的速度离心7min，弃去上清液。 5.15.5.6用同法再固定1~2次，弃去上清液。 5.15.5.7加入数滴新鲜固定液，混匀。 5.15.5.8用混悬液滴片，自然干燥。 5.15.5.9用姬姆萨染液染色。 5.15.6读片和结果评价 选择分散良好的中期分裂相，在显微镜油镜下进行读片，记录畸变类型。所得各组的染色体畸变率用X2检验进行统计学处理，以评价试验组和对照组之间是否有明显差异。 5.16动物骨髓嗜多染细胞微核试验 研究化学物诱发哺乳动物染色体畸变的方法很多，微核试验以其简便、快速，具有一定的敏感性，被广泛应用于遗传毒理学研究中。 5.16.1目的 该试验是一种用体内试验来检查骨髓细胞染色体畸变的方法，特别适用于检出纺锤体的部分损害而出现的染色体丢失或染色单体或染色体的无着丝点断片。 5.16.2试剂和材料 5.16.2.1胎牛血清 将滤菌后的胎牛（或小牛）血清放入56℃恒温水浴中保温30min进行灭活，通常储存于冰箱冰室里。 5.16.2.2姬姆萨染液 称取Giemsa3.8g，加入375ml分析纯甲醇，待完全溶解后，再加125ml甘油，放37℃恒温箱中保温48h，保温期间振摇数次，以促充分溶解，取出过滤，两周后用。 5.16.2.3 Giemsa应用液的配制 取一分Giemsa应用液与6份磷酸盐缓冲液混合而成。 5.16.2.4 1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4） 称取Na2HP4.12H2O 19.077g KH2PO4 1.814g 加蒸馏水至 1000ml 5.16.2.5解剖剪、镊子（大、小）各一把、止血钳、载物片、盖玻片（24mm×50mm）、塑料洗瓶、滤纸、纱布；甲醇（分析纯）、二甲苯、生物显微镜。 5.16.4实验动物和剂量分组 小白鼠是微核试验的常规动物，也可选用大白鼠，一般常用体重为25~30g的小鼠或体重为150~200g的大鼠，雌雄皆可，每个剂量组至少5只动物，另外设溶剂对照组和阳性物组。常用环磷酰胺做为阳性对照物。 根据受试物理化性质（尤其是水溶性-脂溶性），确定受试物所用的溶剂，常用水、植物油（玉米油等）或吐温-80等溶剂。剂量的选择是很重要的，用药量太低，会漏掉阳性物，用药量太大，可致动物死亡，或因对骨髓毒性作用太强，致使嗜多染红细胞受到抑制，难以获得正确的结果。一般取受试物LD50的1/2、1/5、1/10、1/20等剂量，以求获得微核的剂量-反应关系曲线。 5.16.4给药途径和方式 给药途径视试验目的而定，常用经口灌胃方式，建议采用30h给药法，即两次给药间隔24h，第二次给药后6h取材。 5.16.5试验方法 5.16.5.1骨髓液的制取 动物脱颈处死，打开胸腔，沿着胸骨与肋骨交界处剪断，剥掉附着胸骨上的肌肉，擦净血污，横向切断胸骨，暴露骨髓腔，然后用小止血钳挤出胸骨骨髓液。 5.16.5.2涂片 将骨髓液滴在载物片一端的胎牛血清液滴里，仔细混匀，一般来讲，两节胸骨骨髓液涂一张片子为宜，然后按血常规涂片法涂片，约2~3cm长度，将载物片在空气中晾干，若立即染色，需在酒精灯火焰下方稍微烘烤一下。 5.16.5.3固定 已干的涂片放入甲醇中固定5~10min，既使当日不染色，也应固定后保存。 5.16.5.4染色 将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色10~15min，然后立即有pH7.4磷酸盐缓冲液冲洗。 5.16.5.5封片 用滤纸及时擦干染片背面的水分，再用双层滤纸轻轻按压，并吸附染片上残留的水分，尽量吸净，再在空气中摇动数次，以促尽快晾干，然后放入二甲苯中，透明5min，取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。 5.16.6观察和计数 先用低倍镜，后用高倍镜粗检，选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，再用油镜下计数。虽然不计数有核细胞的微核，但需用有核细胞形态完好做为判断制片优劣的标准。 本法系观察嗜多染细胞的微核，嗜多染细胞呈灰蓝色，而成熟的红细胞呈粉红色。微核大多数呈圆形、单个的、边缘光滑整齐、嗜色性与核质一致、呈紫红色或蓝紫色。 每只动物计数1000个嗜多染红细胞。微核率指含有微核的嗜多染细胞数，以千分率表示。一个嗜多染细胞中出现致命两个或多个微核，仍按一个计数。 5.16.7结果评价 微核试验结果的统计学处理，推荐下述方法： 首先找出受试物各剂量组和对照组微核95%可信限：查普阿松分布（λ）的可信限表，阳性物组的95%可信限按正态分布处理。然后绘出受试物各剂量组和对照组的95%可信限的直线图，最后，各剂量组与对照组进行U检验。 根据统计处理来评价受试物是否具有染色体畸变作用。 5.17小鼠精子畸形检测试验 5.17.1意义：一般认为异常精子数的增加可能是在精子发生中造成遗传损伤的结果。因此，小鼠精子形态试验可用于鉴别能引起精子发生功能异常以及引起突变的化学物质。 5.17.2动物：成年雄性小鼠，体重25~35g。 5.17.3剂量选择和动物分组：设1/2、1/5、1/10和1/20LD50剂量组以及阳性对照和阴性对照组。阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，剂量为40mg/kg体重。阴性对照组为溶剂对照。 5.17.4染毒方式：经口灌入受试物，连续5天，每天一次。 5.17.5实验步骤 5.17.5.1于染毒后4周用颈椎脱臼的方式处死动物，剖腹，取出附睾。 5.17.5.2将附睾放入盛有2ml生理盐水的小平皿中，用虹膜剪剪碎。 5.17.5.3以三层擦镜纸过滤，滤液以1000r/min的速度离心5min，去除上青液。 5.17.5.4加入少量生理盐水，以混悬液涂片，自然干燥。 5.17.5.5将玻片置甲醇中固定5min，用2.5%伊红染色1h，封片。 5.17.5.6在显微镜（40×10）下计数2000个精子中畸变的精子数，精子畸形的分类按Wyrobeks的方法进行。 5.17.6结果评价 用柯莫洛夫-斯未尔诺夫检验方法进行统计学处理。 具体方法主参考《中国医学百科全书》医学统计学部分，第160页“频数分布的拟合优度”，上海科学技术出版社，1985。

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