范围，大鼠200~300g，家兔2.0~3.0kg，豚鼠350~450g。 动物皮肤的准备和受试物的配制，参见急性皮肤毒性试验，不过一般需每天或两三天剪毛一次。 5.8.4剂量和分组：至少有三个剂量组和一个赋形对照组。每个剂量组至少20只动物，雌、雄动物各10只。最高剂量组可出现毒性反应，但不能出现死亡。最低剂量组不能出现任何毒性反应。理想的中间剂量，应产生最小的可观察到的毒性反应。如果受试物涂抹后产生了严重的皮肤刺激毒性，应该中止试验，重新设计试验方案，使新设计的最高剂量组，由于浓度的降低致使皮肤刺激反应减弱或消失。 5.8.5试验方法：将受试物涂抹于动物背部皮肤，涂皮面积参见急性皮肤毒性试验，对毒性强的物质，涂抹面积可适当减少。实验期限为90天。 5.8.5.1临床检查：整个试验过程中，注意观察并记录动物的一般表现、行为、中毒症状和死亡情况。每周称体重一次，并调整敷药量。 5.8.5.2血液学检查：一般于试验结束时测定之。包括项目：血色素含量、红细胞数、白细胞数及其分类计数、血小板数、网织红细胞数等。 5.8.5.3血液生化学检查：一般认为适合于所有研究的测试范围是肝、肾功能、碳水化合物代谢、电解质平衡。特殊测定之项目由受试物的作用方式来决定。建议的项目有：谷丙转氨酶、谷草转氨酶，血中尿素氮、非蛋白氮及肌酐含量，血清中白蛋白/球蛋白等。必要时，可根据所观察的毒性反应选择其他的临床生化学指标。 5.8.5.4脏器称重：肝、肾和其他脏器的绝对重量和脏/体之比的测定。 5.8.5.5病理学检查：试验结束时，处死所有动物，进行大体尸检，并将主要器官和组织固定保存、制片和镜检。在各剂量组动物大体检查无明显病变时，可以只进行高剂量组和对照组动物主要脏器（肝、肾、脾、肠等）和皮肤的组织病理学检查，发现病变后再对较低剂量组相应器官及组织进行镜检。许多毒物可引起肝、肾组织病变，故肝、肾的镜检已列入常规项目，其他器官或组织的镜检则需根据情况而定。 5.8.6试验的意义和价值 亚慢性皮肤毒性试验提供重复皮肤接触受试物时动物机体反应的资料。虽然从实验结果外推到人的正确性是有限的，但它能提供关于化学物经皮肤吸收程度的有用资料。若实验结果表明受试物经皮吸收可能性甚微或几乎无可能性。则没有必要进行经皮慢性毒性和致癌试验。 5.9亚慢性经口毒性试验 5.9.1目的：确定受试物重复经口给予动物可能引起健康的潜在危害，为提供靶器官、蓄积可能性和慢性/致癌性实验提供实验依据。 5.9.2定义：系指动物多次重复经口接受化学物质所引起的不良反应。 5.9.3动物的选择：一般选用啮齿类动物，首选品种为大鼠。使用雌雄两种性别，理想的给药时间是小于6周令。 5.9.4剂量和分组：至少应有三个剂量组和一个对照组。每个剂量组至少20只动物，雌雄各10只。各剂量组选择的原则同亚慢性经皮毒性试验。 5.9.5试验方法：给药方式可采用受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式。当受试物掺入饲料时，要确保给药量不能影响动物正常的营养需要。以灌胃方式给药时，每周称体重。并按体重调整给药量，以维护稳定的给药量。 在整个实验过程中，动物一般观察、临床检查和病理检查的原则和具体要求，参见亚慢性皮肤毒性试验。 5.9.6试验的意义和价值；亚慢性经口毒性试验将提供重复经口给药后动物所表现的不良反应的资料。虽然从动物实验结果外推到人的正确性是有限的，但它能提供无反应剂量和可允许的人类接触量的有用资料。 5.10致畸试验 5.10.1目的：致畸试验是鉴定化学物质是否具有致畸性的一种方法。通过致畸试验，一方面鉴定化学物质有无致畸性，另一方面确定其胚胎毒作用，为化学物质在化妆品中安全使用提供依据。 5.10.2定义：胚胎发育过程中，接触了某种有害物质影响器官的分化和发育，导致形态和机能的缺陷，出现胎儿畸形，这种现象称为致畸作用。引起胎儿畸形的物质称为致畸原。 5.10.3器材和试剂 5.10.3.1生物显微镜、体现显微镜、放大镜、扭力天平、游标卡尺、眼科镊子、眼科剪、平皿、滤纸等。 5.10.3.2 1/1000茜素红溶液：茜素红0.1g，氢氧化钾10g，蒸馏水790ml。 5.10.3.3透明液a：甘油200ml，氢氧化钾10g，蒸馏水790ml。 5.10.3.4透明液b：甘油与蒸馏水等量混合。 5.10.3.5固定液（Bouins液）：苦味酸饱和液75份，甲醛20份，冰醋酸5份。 5.10.4实验动物的选择：常用的实验动物是小白鼠、大白鼠和兔，大、小白鼠为首选动物。选用健康性成熟的大鼠90~100天龄，雌性应是初产的。 5.10.5剂量和分组：至少设4组，其中三组给药组和一组空白对照组。每组至少12只孕鼠。初次进行致畸试验可引入新的动物种株时，需要设阳性对照组。常用阳性对照物有敌枯双、五氯酚钠、维生素A等等。根据受试物的动物半数致死量（LD50）和蓄积性的大小，确定受试物的给药剂量，应该包括无作用剂量组，有致畸作用剂量组和明显致畸剂量组。 5.10.6试验方法 5.10.6.1“孕鼠”的检出和给药时间 雌鼠和雄鼠按1：1（或2：1）同笼，每日晨观察阴栓（或阴道涂片），查出阴栓（或精子）的当天定为孕期零天。如果五天内没查出“受精鼠”，应调换雌鼠。检出的“受精鼠”按随机分组。称重和编号。在大鼠孕期6~15天期间，每天灌胃给药。孕鼠于孕期0日、6日、10日、15日和20日称重，并根据体重调整给药量。 保持动物室内环境安静，室温控制在20℃~25℃为宜，适当地给孕鼠增加营养。如加麦芽或蛋糕等。 5.10.6.2孕鼠处死和一般检查 第20天孕大鼠用20%硫贲妥钠1~1.5ml腹腔注射麻醉断头处死。剖腹腔检查卵巢内黄体数，取出子宫，称重；检查活胎、早期吸收和迟死胎数目。 5.10.6.3活胎鼠的检查 逐个记录活胎鼠体重，性别，体长。外观检查头颅外形、面部、躯干、四肢等有无畸形，包括：露脑、脑膨出、眼部畸形（小眼、无眼、睁眼等）鼻孔扩大，单鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢及尾畸形等等。 5.10.6.4胎鼠骨骼标本的制备 每窝约2/3活胎鼠以眼科镊子剥皮，小心挖掉胸腹腔内脏，去掉后颈和两肩胛骨之间的脂肪块，然后将胎鼠放入茜素红溶液软化染色。当天下午摇动玻璃瓶2~3次，视气温情况需染色半天至两天，至头骨染红为止。第二（或三）天，将胎鼠换入透明液A，第三（或四）天，将胎鼠换入透明液B，第四（或五）天，胎鼠骨骼染红而软组织的紫红色基本退色，可换入甘油中。 5.10.6.5胎鼠骨骼检查 染好的标本连同甘油一起倒入小平皿内，在体视显微镜下，用透射光源，先观察胎鼠全身，然后逐步检查骨骼。首先，测量囱门的大小，矢状缝的宽度，观察是否囱门扩大，矢状缝增宽，头顶间骨及后头骨缺损。然后，检查胸骨的发育和数目，是否胸骨缺失或融合。肋骨常见畸形有融合肋，分叉肋，肋骨中断，缺肋，短肋，波状肋，多肋等；脊柱骨的缺失、融合、纵裂等畸形；另外，检查骨盆，四肢骨等是否有畸形。 5.10.6.6胎鼠内脏检查 每窝约1/3活胎鼠浸入Bouins氏液后一周作内脏检查。先用自来水冲去固定液，把胎鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾巴，用刀片从头部开始，往下逐渐经颈、胸腹部共切6刀。第6刀切完后，可以用小剪刀剖开腹腔，仔细检查消化系统和泌尿生殖系统各器官的大小、形态以及位置。 5.10.7统计处理和结果评价 受精鼠数、受孕鼠数、孕鼠死亡数，有一个以上活胎孕鼠数，用卡方检查；窝平均黄体数、窝平均着床数、窝平均活胎数以及活胎鼠平均体重用T检验；吸收胎和迟死胎用非参数统计，窝畸形率、胎鼠畸形率用非参数统计。 结果应能得出受试物是否有母体毒性，胚胎毒性以及致畸性。如果受试物有致畸效应，可以得出最小致畸剂量。为了比较不同化学物的致畸性强度，可用致畸指数来表示： 致畸指数=雌鼠LD50/最小致畸剂量 暂以致畸指数10以下为不致畸，10~100为致畸，100以上为强致畸。 致畸危害指数=最大不致畸剂量/最大可能摄入量 如果致畸危害指数>300，说明受试物对人体危害小，100~300为中等，<100为大（暂定）。 5.11慢性毒性试验 5.11.1目的：确定动物长期接触化学物质后所产生的危害。 5.11.2定义：系指动物长期接触受试物所引起的不良反应。 5.11.3动物的选择：一般建议两种哺乳动物，常用大鼠和小鼠。使用两种性别。试验开始时选用刚断乳的动物。 5.11.4剂量和分组：一般至少设三至四个剂量组和一个对照组。大鼠至少20只每组每性别，小鼠比大鼠适当增加数量。在慢性毒性试验中，最好要有剂量反应关系。最高剂量组应引起毒性反应或明确的损害作用，低剂量组不应引起毒性作用或有害影响。 5.11.5试验方法：慢性经口或皮肤毒性试验，分别采取相应的给药途径，具体方法参见相应的亚慢性毒性试验，试验期限至少为6个月，甚至一年。 整个试验期间，对动物的一般观察、临床检查和病理学检查，参见亚慢性毒性试验。除此而外，还有一些具体要求： 在试验的头三个月，每周称重一次；在4~6个月期间，每两周称重一次，以后每四周称重一次。 在试验开始后的第三个月、第六个月和试验结束时，进行血液学和临床生化学有关指标的测定。一般从每组每种性别中选10只动物进行测定。如果可能的话，最好每次血样来自相同的动物。 测定脏器的绝对重量和脏体之比，至少包括肝、肾、脾、睾丸和脑等脏器，必要时还应选择其他脏器。 试验结束时，对全部的动物，包括试验过程中死亡的或因处于垂死状态而被处死的动物都应进行全面的肉眼检查。 对所有动物（包括中途死亡或处死的）的主要器官和组织（包括皮肤）以及所有肉眼可见的病变、肿瘤或可疑为肿瘤的组织，都应进行病理组织学检查。 5.11.6试验的意义和价值：慢性毒性试验为提供人体长期接触该化学物质的最大耐受量或安全剂量提供资料。 5.12致癌试验 5.12.1目的：确定经一定途径长期给予试验动物不同剂量的受试物的过程中，观察其大部分生命期间肿瘤疾患产生情况。 5.12.2定义：系指动物长期接触化学物质后引起的肿瘤危害。 5.12.3动物的选择；建议对活性不明的化学物质采用两种动物，一般优先选用小鼠和大鼠，动物的敏感性对试验影响很大。一般来讲，用小鼠诱发肝癌比大鼠容易，相反地，诱发皮下肿瘤则大鼠比小鼠更容易。小鼠和兔子的皮肤对局部涂抹诱发肿瘤可能比大鼠和地鼠更为敏感。 两种性别都应该使用，常使用刚断乳或已断乳的大鼠进行致癌试验。 5.12.4剂量和分组：至少三个组和一个对照组。最高剂量组应足以引起最低毒性反应，又没有因肿瘤以外的因素和明显改变其正常生命期限。这些毒性反应可能表现为血清酶水平的改变，或体重增加受到轻度抑制（降低百分之十）。最低剂量应该不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不能引起任何毒性表现。中间剂量应该处于最高和最低剂量的中间范围。 每个剂量组和对照组的每种性别至少25~50只动物。 试验期限：应该包括动物正常生命期的大部分时间。建议参考下面几条准则： 一般情况，试验结束时间对小鼠和地鼠应为18个月，大鼠为24个月。 当最低剂量组或对照组存活的动物数只有百分之二十五进，也可以结束试验。对于有明显性别差异的试验，则其结束的时间，不同的性别应有所不同。若高剂量组因明显的毒性作用造成过早死亡，此时不应结束试验。 一个合格的阴性对照试验应符合下列标准： 因疾病、被同类吃掉，或因管理问题所造成的动物损失在任何组都不能高于百分之十。 小鼠和地鼠在18个月，大鼠在24个月时，各组存活的动物不能少于50%。 5.12.5试验方法：给受试物的途径，根据受试物的理化特性和对人有代表性的接触方式（经口或皮肤涂抹）而定。 整个致癌过程中，注意观察并记录动物出现的症状或死亡情况，尤其要注意肿瘤发生情况，每一个肉眼可见的或触及的肿瘤出现的时间、部位、大小、外形和发展情况都应记录。 在试验的前三个月，每周称量一次，以后每四周称量一次。 在实验过程中死亡或因处于垂死状态而被处死，以及试验结束时全部宰杀的动物，都应进行完整的大体尸检。 所有动物的全部器官和组织都应保留以进行镜检，但实际上是有困难的，只能有选择地进行，至少下述情况要进行镜检： 各组所有肉眼可见的肿瘤或可疑肿瘤的病变。 最高剂量组和对照组动物，以及试验过程中死亡或处死的所有动物所保留的器官和组织。详细描述增生、瘤前病变或肿瘤的形态学改变。 如果在最高剂量和对照组之间，增生、瘤前病变或肿瘤有明显区别，则应该对该试验各组所有动物的特殊有关的器官和组织进行镜检。 如果实验结果表明动物正常寿命有明显改变或产生了一些能影响肿瘤发生的作用，则下一低剂量组动物也应按上述方式进行镜检。 5.12.6致癌试验结果的评价 采用联合国世界卫生组织提出的四条判断诱癌试验阳性的标准： 肿瘤只发生在试验组动物中，对照组无肿瘤。 试验组与对照组动物均发生肿瘤，但试验组中发生率高。 试验组动物中多发性肿瘤明显，对照组中无多发性肿瘤或小数动物有多发性肿瘤。 试验组与对照组动物肿瘤的发生率无明显差异，但试验组中肿瘤发生的时间较早。 上述四条中，试验组与对照组之间的数据经统计学处理后任何一条有显著的差异时即可认为检品的诱癌试验属阳性。动物致癌试验为人体长期接触该物质是否引起肿瘤的可能性提供资料。 5.13鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验） 鼠伤寒沙门氏菌组氨酸（his）回复突变系统是一种微生物试验。该试验用于测定可引起沙门氏杆菌基因碱基置换和/或移码突变的化学物质所诱发的his~ his+的回复突变。 5.13.1定义：用来测定依赖于组氨酸的菌株产生不依赖于组氨酸的基因突变。 碱基型突变剂：它引起DNA分子碱基对置换。 移码型突变剂：它引起DNA分子增加或缺失一个或多个碱基对。 5.13.2鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株鉴定 菌档：建议使用TA98、TA100、TA97和TA102等四种组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株。 增菌培养：将贮存菌接种于5ml营养肉汤中，于37℃振荡培养10h。 5.13.2.1组氨酸需求试验 凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上则不能生长。 鉴定方法：将试验菌株分别接种于含组氨酸培养基和无组氨酸培养基平板，于37℃培养24h，观察细菌生长情况。 结果判断：试验菌株在含组氨酸平板上生长，在不含组氨酸平板上不会生长。 5.13.2.2脂多糖屏障缺陷鉴定 粗糙型突变的微生物，其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏，因此一些大分子物质能穿过菌膜进入菌体内而抑制其生长，野生型菌株或含gal缺失的菌株则不受影响。 鉴定方法：含0.1ml试验菌株增菌液的顶琼脂培养液倒入肉汤琼脂平板上，冷凝后中央放置无菌圆形滤纸片，滴上10μl的0.1%结晶紫溶液。经37℃培养24h观察结果。 结果判断：在滤纸片周围出现一个透明的抑菌环，说明此菌存在深粗型（rfa）突变。TA98、TA100、TA97和TA102均有抑菌环，野生型鼠伤寒杆菌没有抑菌环。 5.13.2.3对氨苄青霉素的抗性鉴定 含R因子的试验菌株对氨苄青霉素具有抗性。因R因子大太稳定容易丢失从而使试验菌株丧失R因子的特性，因此需要鉴定R因子是否存在。 鉴定方法：将试验菌株于肉汤琼脂平板上划线，然后把沾有氨苄青霉素溶液滤纸条与划线交叉放置，37℃培养24h后观察结果。 结果判断：具有R因子的试验菌株（TA98、TA100、TA97和TA102）有抗氨苄青霉素作用，故滤纸条周围照常生长。 5.13.2.4对紫外线敏感性的试验 具有uvrB修复缺陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此可以证明-uvrB突变的存在。 鉴定方法：将试验菌株在肉汤琼脂平板上划线，然后用黑纸覆盖平板的一半，在15W的紫外灯下，距离33cm处照射8s，37℃培养24h后观察结果。 结果判断：对紫外线敏感的菌株（TA98、TA100、TA97），仅在没有照射的那一半生长，而具有野生型切除修复酶的菌株（TA102）仍能生长。 5.13.2.5四环素抗性的鉴定 鉴定方法：将试验菌株增菌液在营养肉汤平板上划线，待干后，吸取四环素（8mg/ml）溶液与菌株划线处交叉划线，经37℃培养24h后观察结果。 结果判断：对四环素的抗性的TA102菌株生长不受抑制，对四环素没有抗性的菌株，因此在四环素带的周围有一段生长抑制区。 5.13.2.6阳性突变剂的敏感性的鉴定 试验菌株对阳性突变剂的敏感性鉴定结果，参见下表。 5.13.2.7自发回变 诱变剂 剂量 S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 柔毛霉素叠氮化钠 2，4，7-三硝基-9-芴酮 4-硝基-0-次苯二胺 4-硝基喹啉-N-氧化物甲基磺酸甲酯 2-氨基芴苯并（A）芘 6.0μg 1.5μg 0.20μg 20μg 0.5μg 1.0μg 1.0μg 1.0μg - - - - - - + + 124 76 8377 216． 528 174 1742 337 3123 3 8244 1599 292 23 6194 143 47 3000 400 798 4220 2730 3026 937 592 188 16 0 287 6586 261 255 在诱变试验中，不同的试验菌株有不同的自发回变数，通常以每皿的回变菌落数为表示。各种试验菌株的自发回变数如下： TA97（90—80），TA98（20—50），TA100（100-200）TA102（240—320）。 经过体外代谢活化系统后的自发回变数，要比不经体外代谢活化系统的自发回变数略高。 5.13.3大鼠肝微粒体酶（S-9）的诱导和制备 选健康雄性大白鼠体重200克左右，将多氯联苯溶于玉米油中，浓度为200mg/ml，一次腹腔注射PCB剂量为500mg/kg体重。第五天断头处死动物，处死前12h停食不停饮水。消毒动物皮毛，打开腹腔，取出肝脏后，用0.15mol/kcl溶液多次冲洗，每克肝脏加0。15mol/lkc13ml后，用剪刀剪碎肝脏，并在玻璃匀浆器中制成肝匀浆，然后在低温高速离心机上，以9000g离心10min，然后分装保存于液氮或-80℃冰箱中。 制备S-9的一切器皿均经消毒，全部操作在在冰水浴中进行。S-9制备后，其活力必须以标准致癌物进行测定。 5.13.4受试物的剂量选择和常用溶剂 受试物的剂量选择范围在0.1μg~5mg或对细菌产生毒性能剂量之间。常用的溶剂为二甲基亚砜，除此之外，还可以选择丙酮、二甲基甲酰胺、甲酰胺、95%乙醇等溶剂，最高加入量为0.1ml。每种受试物至少三个剂量，每个剂量至少三个平板。 5.13.5试验方法 5.13.5.1直接平板掺入法：将含0.5m mol/l组氨酸-生物素的顶层琼脂2.0ml分装于试管中，45℃恒温水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1ml、受试溶液0.1ml和s-9混合液0.5ml（需代谢活化时）混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平板，使之分布均匀，冷凝固化，37℃下培养48h后，计数每皿回变菌落数。 突变试验中，除样品各剂量组外，还应设溶剂对照、空白对照、阳性突变剂对照和无菌对照。 5.13.5.2点试法：方法基本同平板掺入法，不同的是，将含菌液（或S-9混合液）的顶层琼脂倒入底层培养基上，然后取直径约6mm无菌圆形滤纸片放在已固化的顶层培养基中央位置。再滴入受试物溶液或直接将受试物放在平皿中央，37℃培养48h后观察结果。 5.13.6结果评价：如果受试物的回变菌落数超过自发回变菌落数的两倍以上，并经统计学处理证明有剂量-回变反应关系者和可重复性，则定为阳性。 5.13.7培养基和试剂的制备 5.13.7.1顶层培养基 琼脂 1.2g 氯化钠 1.0g 蒸馏水 200ml 121℃（151b）30min高压消毒后，加入0.5m mol/l组氨酸-生物素溶液20ml。 5.13.7.2底层培养基 琼脂 7.5g 蒸馏水 465ml 121℃（151b）30min高压消毒后，加入（V-B）培养基E10ml和40%葡萄糖溶液25ml，混匀，按每皿30ml倒平皿，冷凝因化后倒置于37℃培养箱中24~48h。 5.13.7.3 Vogel-Bonner（V-B）培养基E 硫酸镁（MgSO4·7H2O） 10g 枸橼酸（C6H8O7·H2O） 100g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 500g 磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O） 175g 先将后三种溶解后，再加入硫酸镁，等完全溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水稀释至1000ml，分装于锥形瓶里，121℃（151b）30min高压消毒。 5.13.7.4 40%葡萄糖溶液 称取400g葡萄糖，加入蒸馏水稀释至1000ml，115℃（101b）20min高压消毒。 5.13.7.5肉汤培养基 牛肉膏 2.5g 胰胨 5.0g 氯化钠 2.5g 磷酸氢二钾 1.0g 蒸馏水 500ml 121℃（151b）30min高压消毒。 5.13.7.6肉汤斜面或平板 琼脂粉 7.5g 肉汤培养基 500ml 121℃（151b）30min高压消毒后，倒斜面或平皿。用于菌株鉴定或常规试验用菌株保存。 5.13.7.7 0．5m mol/l组氨酸-生物素溶液 D-生物素（分子量247.3） 30.9mg L-组氨酸盐酸盐（分子量191.7） 24.0mg 加蒸馏水至 250ml 121℃（151b）20min高压消毒。 5.13.7.8 S-9混和液配制（按每亳升S-9混合液计算） 大鼠肝S-9 100μl MgCl2-KC1盐溶液 20μl 6-磷酸葡萄糖V 5μmol 辅酶ⅡV 4μmol 0.2mol/L磷酸盐缓冲液 500μl 无菌蒸馏水 380μl 5.13.7.9盐溶液（1.65mol/LKC1+0.4mol/L MgCl2） 氯化钾（KC1） 61.5g 氯化镁（MgCl2.6H2O） 40.7g 蒸馏水加至 500ml 121℃（151b）20min高压消毒。 5.13.7.10 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4） 磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O） 0.593g 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 5.803g 蒸馏水 100ml 121℃（151b）20min高压消毒。 5.13.7.11 0.15mol/L氯化钾溶液 精确称取氯化钾11。18g，用蒸馏水稀释至1000ml，121℃（151b）30min高压消毒，冷却后冰箱保存，用于S-9制备。 5.13.7.12氨苄青霉素溶液（8mg/ml） 称取三羟氢苄青霉素80mg，加入0.02n氢氧化钠溶液10ml。 5.13.7.13 0.1%结晶紫溶液 称取结晶紫10mg，加10ml无菌水即成。 5.13.7.14四环素溶液（8mg/ml） 称取四环素40mg，加入0.02n盐酸溶液5ml，用于四环素抗性试验。 5.14体外哺乳动物细胞的染色体畸变和SCE检测试验 5.14.1意义：用哺乳动物细胞染色体畸变和姐妹染色单体交换率的检测不评价致突变物是世界上常用的短期生物试验方法之一。方法较简单、快速。 5.14.2试剂配制 5.14.2.1阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择不同之阳性对照物，例如黄曲霉素B1和苯并（A）芘等。 5.14.2.2受试物：最好溶于培养液中，也可溶于二甲基亚砜（DMSO）中，其浓度应低于0.5%。 5.14.2.3培养液：采用MEM（Eagle），并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、链霉素，按100IU/ml），胎牛血清按10%加入。 5.14.2.4肝匀浆S-9混合物： S-9的制备同Ames试验，按下列配方配制S-9混合物： S-9 0.125ml MgCl2（0.4mol/L） 0.02ml KC1（1.65mo1/L） 0.02ml 葡萄糖-6-磷酸 1.791mg 辅酶Ⅱ（氧化型，NADP） 3.0615mg 用MEM培养液补足至1ml。 5.14.3实验程序 5.14.3.1细胞：使用中国地鼠卵巢（CHO）细胞株。 5.14.3.2实验前一天，将1×106细胞接种于直径为6cm的玻璃培养皿中，放培养箱内待用。 5.14.3.3实验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、肝匀浆S9混合物

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