皮肤一般可以分为3层:表皮层、真皮层和皮下组织层。角质层是皮肤表皮的最外层,主要由角质形成细胞构成,是皮肤的天然屏障。随着生活水平的提高,人们要求护肤品有良好的保湿和抗皮肤衰老等功能。保湿剂有助于在干燥的空气中保持皮肤角质层正常的水分(质量分数为:10%～20%),防止皮肤因水分不足而产生皱裂、粗糙等。在国内,天然保湿剂成为护肤品研究热点之一,已有很多关于壳聚糖及其衍生物保湿性能的研究,但是有关天然胶原的护肤功效鲜为报道。国外有了关于胶原作为护肤品的报道,一些知名品牌公司也推出了纯胶原和一系列添加了纯胶原的护肤品。目前国产护肤品中添加的胶原蛋白主要是胶原的变性或水解产物———明胶或水解胶原蛋白。作者研究室率先研制出纯天然胶原护肤品,并已申请了国家发明专利。胶原、明胶和水解胶原蛋白虽然都可以从动物体同一组织(如皮肤、骨骼)中制备,但是由于制备工艺条件不同,使它们具有不同的分子结构和物理化学性能。此研究所用胶原、明胶和水解胶原蛋白都是来源于动物的皮肤组织(以Ⅰ型胶原为主)。Ｉ型胶原是具有生物活性的重要结构蛋白,由两条相同的α1链和一条α2链组成,每一条α链自身为左手螺旋构型,3条α链又相互缠绕在一起形成右手超螺旋结构。明胶和水解胶原蛋白都是胶原变性水解产物,天然的三股螺旋结构都被破坏,且无生物活性,只是水解胶原蛋白的水解程度更大,相对分子质量更低。作者通过测定3种样品的相对黏度、特性黏数以及自由氨基含量,说明其吸湿、保湿性能差别的原因。并且,利用荧光标记样品方法以及角质形成细胞培养实验比较这3种样品的护肤功能。

1　实验部分

1 .1　主要仪器及试剂

        ＨＺＳ-Ｈ水浴振荡器,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;ＧＬ-20Ｇ-Ⅱ型高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂;ＵＶ751ＧＤ紫外/可见分光光度计,上海分析仪器总厂;ＳｔｏｐｐｅｒｉｎｇＴｒａｙＤｒｙｅｒ7948030冷冻干燥机,ＬＡＢＣＯＮＣＯＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ;ＢＨ2-ＲＦＬ荧光显微镜,ＯＬＹＭＰＵＳ,日本。胃蛋白酶、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏ ｄａｍｉｎｅｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ(ＴＲＩＴＣ)、胰蛋白酶、明胶,华美生物工程公司;牛血清白蛋白,北京元亨圣马生物技术研究所;三硝基苯磺酸(ＴＮＢＳ),ＳＩＧＭＡ,美国。

1. 2　实验方法

1 .2 .1　胶原的制备

        从屠宰场购买新鲜的牛皮,经脱脂、脱毛处理后,在低温下用胃蛋白酶提取胶原,经分离纯化处理后,冷藏备用。用Ｂｅｒｇｍａｎ和Ｌｏｘｌｅｙ方法测定羟脯氨酸质量浓度,从而确定胶原的质量浓度。

1 .2 .2　水解胶原蛋白的制备

        称20ｇ明胶溶于去离子水中,取一半用0 4ｇ胰蛋白酶在40℃水解4ｈ,得到水解胶原蛋白1#。另一半加入0 04ｇ胰蛋白酶在同样条件下反应4ｈ得到水解胶原蛋白2#。用Ｂｉｕｒｅｔ方法测定水解胶原蛋白的质量浓度。

1 .2 .3　相对黏度及特性黏数测定

        水解胶原、明胶和胶原的相对分子质量都比较大,具有高聚物的性质。相对黏度(相对于溶剂水)可以反映样品绝对黏度的大小。通过测定它们不同质量浓度稀溶液的相对黏度,再用哈金斯外推方法计算求得特性黏数。由于它们之间黏度差异很大,实验控制溶液流出毛细管的时间为100ｓ～200ｓ,恒温水浴温度20℃±0 5℃。

1 .2 .4　样品的自由氨基质量摩尔浓度测定

        样品的自由氨基质量摩尔浓度(以每克蛋白质所含的自由氨基的物质的量计)在一定程度上反映出单位质量样品的亲水基团含量(以每克蛋白质所含的亲水基团的物质的量计)。实验通过三硝基苯磺酸(ＴＮＢＳ)方法[8]测定蛋白质溶液中的自由氨基的物质的量浓度ｃ(ｍｍｏｌ/Ｌ),再测定该溶液中的蛋白质质量浓度ρ(ｇ/Ｌ),则自由氨基质量摩尔浓度=ｃ/ρ(ｍｍｏｌ/ｇ)。
                          图1　样品的吸湿和保湿性能

        甘油分子小,亲水基团(羟基)含量大,吸湿效果最为明显。胶原虽然亲水基团的含量不大,但是其具有特有的三股螺旋结构,因此吸湿效果仅次于甘油。对于三股螺旋被破坏的明胶和水解胶原蛋白,亲水基团含量大的,吸湿性强。

        保湿性也与分子结构和亲水基团的含量有关,从实验结果看出,这几类蛋白样品有着相似的保湿效果。但是,图1中ａ、ｂ所示的吸湿、保湿性测定方法仅能反映样品自身的吸湿和保湿性,未能反映出它们对皮肤保湿性的优劣。下面实验以大白鼠皮肤模拟人体皮肤,观察荧光标记样品在大白鼠皮肤的表面分布和皮内的渗透情况,可更加真实的反映样品的保湿性能。

2 4　荧光标记样品的性能比较

          在大白鼠背脊皮肤涂上荧光标记样品后,立即处死大白鼠,剥取皮肤,观察3种样品初始分布,其荧光显微镜图中Ａ1、Ｂ1、Ｃ1;12ｈ后处死大白鼠,剥取皮肤,其截面的荧光显微镜图见Ａ2、Ｂ2、Ｃ2。刚涂上样品时:Ａ1胶原,Ｂ1明胶,Ｃ1水解胶原蛋白;涂上样品12ｈ后:Ａ2胶原,Ｂ2明胶,Ｃ2水解胶原蛋白。

         从Ａ1、Ｂ1、Ｃ1可以看出,荧光标记样品初始分布都比较均匀,没有渗透到皮肤以及毛囊中去。而从Ａ2、Ｂ2、Ｃ2可以看出,3种样品都渗透到毛囊中去了,但是在皮肤表面的情况却有所不同:胶原在皮肤表面和毛囊中都存在,并且在皮肤表面均匀分布;明胶也存在于皮肤表面和毛囊中,但是在皮肤表面分布不如胶原均匀;水解胶原蛋白几乎都渗透到毛囊中了。留在皮肤表面的样品可以维持正常水分,起到保湿作用。对于渗透到皮肤及毛囊中的样品可以从角质形成细胞培养实验来说明它们对皮肤的生理作用。

2 5　样品对角质形成细胞生长的影响

         胶原、明胶以及水解胶原蛋白对角质形成细胞的生物活性存在很大的区别。角质形成细胞分别在胶原、明胶和水解胶原蛋白作为细胞生长的底物上培养时,用显微镜观察培养16ｈ后的细胞生长繁殖的情况,(Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ)。

         从实验结果看出胶原具有促进角质形成细胞生长的明显作用,培养后细胞呈现出锥形状,细胞密度明显大于其他3个实验样。而明胶和水解胶原蛋白对角质形成细胞生长无明显促进作用,与空白样相似。因此,胶原、明胶和水解胶原蛋白中只有胶原具有明显促进角质形成细胞生长繁殖的生理活性。而皮肤的衰老表现为皮肤细胞生长繁殖能力下降,表皮重建能力减弱,真皮胶原合成减慢等,所以胶原具有抗皮肤衰老功效,是比较理想的功能型护肤材料。
1 .2 .5　吸湿、保湿性测定

       将样品冷冻干燥后,用烘箱法测定它们的初始水分质量分数。以甘油为参照物,将冻干样品,在相对湿度ＲＨ=81%的干燥器中放置80ｈ左右,测定它们吸湿率与时间的关系。

        吸湿率=[(ｗ1-ｗ0)/ｗ0]×100%

        ｗ0,ｗ1分别为样品放置前和放置一定时间后的质量。吸湿结束后,将样品转移至ＣａＣｌ2干燥器中,测定样品水分残存率与时间的关系。

         水分残存率=[(ｗ2-ｗ0)/ｗ0]×100%

         ｗ0同吸湿实验;ｗ2为放置一定时间后的样品质量。

1 .2 .6　荧光标记样品制备

         取质量浓度为1ｍｇ/ｍＬ胶原、明胶和水解胶原蛋白2#溶液各5ｍＬ,用0 25ｍｏｌ/Ｌ、ｐＨ=9 5碳酸盐缓冲溶液透析处理后,分别与等质量的荧光剂ＴＲＩＴＣ反应,经透析处理,作为实验用样品。

1. 2 .7　冷冻切片样品制备

        选6只9星期大白鼠,将背脊部毛剃除干净,涂上ＴＲＩＴＣ标记的样品。然后,宰杀,剥取皮肤,经冷冻切片后,用荧光显微镜观察荧光标记样品在大白鼠皮肤表面的分布及其在切面的渗透情况。

1 2 8　角质形成细胞的分离和培养

        取新出生的小白鼠皮肤,用胰蛋白酶处理2ｈ,剥取表皮层,粉碎匀浆,反复用培养液冲洗,然后用40μｍ细胞过滤器过滤,经离心后收集角质形成细胞。在37℃、体积分数为5%ＣＯ2培养箱环境中,将提取的角质形成细胞在介质培养液中培养。大约3ｄ～4ｄ后,细胞繁殖成锥形,可用于研究其在不同样品底物上的吸附和繁殖情况。

1 .2. 9　细胞吸附和生长

        在室温下,分别在35ｍＬ培养皿上涂上相同质量浓度的胶原、明胶和水解胶原蛋白2#,2ｈ后在培养皿中加入细胞密度为4×104个/ｃｍ2的角质形成细胞,培养16ｈ后,用显微镜观察细胞的生长情况。

2　结果与讨论

2 .1　相对黏度及特性黏数测定

        黏度法测定得到相对黏度,通过哈里斯外推方法得到截距,由截距与初始质量浓度的比值得到样品的特性黏数([η])。其值的大小与样品的黏均分子质量是相关的,对于同一类的样品来说,一般特性黏数越大,其黏均分子质量也越大。胶原、明胶和水解胶原蛋白的相对黏度及特性黏数见表1。

        从表1看出水解胶原蛋白1#、水解胶原蛋白2#和明胶的相对黏度相差很小,而胶原的相对黏度是其他样品的5倍左右,这与胶原的高相对分子质量及其特殊的高级结构是密切相关的。特性黏数是高聚物的一个物理参数,当聚合物的化学组成、溶剂、温度确定后,[η]值与聚合物的相对分子质量关系,可用Ｍａｒｋ-Ｈｏｕｗｉｎｋ方程表达,即[η]=ＫＭａ。由于这些样品在溶液中所呈现出的形态未知,相对分子质量分布又比较宽,所以特性黏数只能定性地反映出它们相对分子质量的大小。从表1可以看出胶原的特性黏数最大,明胶次之,水解胶原蛋白最小。因而,黏均分子质量从大到小顺序为胶原、明胶、水解胶原蛋白2#和水解胶原蛋白1#。

2 2　样品的自由氨基质量摩尔浓度

         (ｍ-ＮＨ2)样品的自由氨基包括分子链端的氨基以及赖氨酸侧链氨基等,一般自由氨基质量摩尔浓度(ｍｍｏｌ/ｇ)越大,则分子链越短,相对分子质量越低。

         自由氨基质量摩尔浓度多少与样品的处理方式有关,明胶和水解胶原都是胶原水解产物,但后者水解程度更大。所以水解胶原蛋白的自由氨基质量摩尔浓度最大,其次为明胶,胶原的最小。水解胶原蛋白1#比水解胶原蛋白2#的水解程度更大,相对分子质量更小,自由氨基质量摩尔浓度更大。样品自由氨基质量摩尔浓度可以反映其亲水基团的含量,因此单位质量样品亲水基团物质的量大小顺序是:水解胶原蛋白1#>水解胶原蛋白2#>明胶>胶原。

2 3　吸湿、保湿性能

         样品放置于相对湿度为81%的恒温干燥器中,一段时间后,各样品吸湿、保湿性与时间的关系如图1所示。

         从图1中ａ可以看出,吸湿能力从大到小顺序分别是甘油,胶原,水解胶原蛋白1#,水解胶原蛋白2#和明胶;从图1中ｂ可知甘油脱水速率最快,其他几个蛋白样品表现出十分相似的脱水速率。

        吸湿保湿性能与样品的亲水基团的种类和数量以及它们的分子结构有很大的关系。胶原、明胶和水解胶原样品的亲水基团的种类是一样,主要是氨基、羧基,少量的羟基。但是由于制备方法的差异,它们的亲水基团含量和分子结构存在很大差异。胶原的亲水基团含量最小,但是保持着天然的三股螺旋的结构;明胶亲水基团含量介于胶原和水解胶原蛋白之间,不具有三股螺旋的结构;水解胶原蛋白的亲水基团含量最大,也不具有三股螺旋的结构。